Методы измерения уровень гормоновв животноводческой продукции

от

Р. Ferrando
Directeur дю Laboratoire де питание и d'питание
Высшая национальная vétérinaire d'Alfort
94704 Мезон-Alfort (Франция)

ВВЕДЕНИЕ

Вопрос о использовании в животноводстве анаболических агентов, в том числе естественных стероидных гормонов и их производных, была - и продолжает оставаться - плохо сказано, и, следовательно, неправильно. Те, кто принес эту проблему, прежде чем общественность имела ни информации, ни технической компетентности, особенно в биологии, говорить с полной объективностью.

Гормоны найдены в природе во многих продуктах животного происхождения (6, 7) и, как фитогормонов, во многих растениях (3, 5). Лишь некоторые из них поднять проблемы общественного здравоохранения, и они должны быть отделены от других. Действительно, изучение практических и медицинских аспектов использования гормонов в животноводстве должны лежать в основе всех регулирование вопроса, и поэтому любое решение по измерению уровня гормонов.

Значительный объем документации существует на задачи (6), которая, как важно для развитых, для развивающихся стран. Позиции с 1 по 11 в библиографии этой статье указывает на количество общих исследований.

2. Использование гормонов в животноводстве, и его последствия

Чтение многих популярных, и даже официальных документов, показывает, что различные типы анаболических агентов, независимо от их структуры, которые сгруппированы вместе под общим названием гормонов, среди них тех, чья деятельность, как эстрогены подчеркивается и те, которые усиливают мужские черты.

Публикуемые материалы и результаты исследований позволяют выделить три типа анаболических агентов.

Первый тип включает в себя тех, кто не нашел в млекопитающих и птиц, но получается исключительно через органического синтеза: диэтилстильбэстрол (DES) или стильбоэстрон, dienoestrol, гексоэстролацетат и их производных. Эти соединения, активные при пероральном введении или в качестве имплантатов, которые вредны для лабораторных животных, будь дано непосредственно или остатков в плоти и субпродуктов обработанных животных. Использование этих веществ, потенциальная опасность для здоровья человека, запрещено во многих странах, особенно в связи с методами измерения уровней DES в мясе являются ненадежными, так что измерения должны быть сделаны на экскрементах.

Второй тип анаболических средств состоит из природных стероидов, как правило, присутствует во всех животных: тестостерона, эстрадиола, прогестерона, эстрон. Секретируемые эндокринные железы, эти вещества и их производные, хотя всасывается в кишечнике, выключены в печени. Они производят измеримые эффекты только тогда, когда имплантированные.

Третий тип, найденный в высших растений и плесени, состоит из веществ с более или менее ясно, эстрогенная и, порой, анаболической активности. Среди этих фитоэстрогенов, только зеараленон был выделен для использования в производстве животных: а зеранол, это дает хорошие результаты, но оказывает влияние на формирование половых и уровень тироксина в плазме (23). Следует добавить, что Шараф и Гома (21) атрибут эстрогенными эффекты витамины Е, В _6, С и, возможно,, в то время как Нельсон и др. (20) изучали те же эффекты в O-P'-ДДТ.

Эта статья обсуждает только последствия для потребителя использования в животноводстве первых двух типов: синтетические вещества, такие как DES и природные стероиды эстрадиол, прогестерон и тестостерон.

Первое упоминание должно быть сделано из случаев рака влагалища и гипогонадизмом наблюдается в потомстве женщин, получавших DES. Такие наблюдения (17, 18, 22) проверяются исследований, основанных на так называемом методологии реле (13), основан на том, что методы анализа для остатка и его метаболитов не отражают практические реальности, так как они могут привести к Результаты остатков без биологической или наоборот. Кроме того, отдельные биологическая оценка каждого метаболита не отражает общее потребление всех из них. Реле, ферма животных, изменяет эту ситуацию.

Для того, чтобы определить, было ли это верно в отношении первых двух типов анаболических агентов, крыс и мышей обоих полов, полученных (13) сбалансированные диеты, содержащие 20% плоти или 6% от печени мужчины и женщины телят имплантированы DES (24 мг в каждом из двух имплантатов), эстрадиола и прогестерона (20 мг + 200 в двух дозах) или эстрадиол + тестостерон (20 + 200 мг в два приема). Животные были имплантированы в начале периода роста и 60 дней, 38 дней перед убоем.

Химическая измерение остатков показали уровни DES 30 г / кг в плоти, но никто не в печени. Уровни природных стероидных гормонов не превышает уровень в необработанных животных.

Кормление крыс и мышей на плоти DES-имплантированных телят привело к росту у обоих полов, стерилизовать самок и резко атрофированы яички, семенные протоки и пенис мужчины (12, 15). Поведение печени менее ясно. Покровский и др. и Нестерин (2) Аналогичные результаты были получены с плотью. Было также отмечено, что DES сохраняется в течение почти 40 дней в окружающей среде и было обнаружено в люцерны (5, 14).

Животные подается на плоти и печени телят с имплантированными эстрадиола + прогестерон или тестостерон эстрадиол + вела себя таким же образом, как элементы управления, подаваемых на плоти и печени контрольных телят. Через 24 месяцев, процент опухолей (прежде всего молочной аденома, часто в старых крыс Вистар) было то же самое в обеих группах.

Тренболон ацетат (ТБА), тестостерона производной, оставляет мало или без остатка. Измеряется радиоиммуноанализа, Gropp др. (16) также изучали биологическое действие методом реле токсичности, на Sprague-Dawley крыс, которых кормили на плоти телят имплантированных смесью 20 мг эстрадиола-17β + 140 мг ТБА, а также с дозами 10 и 25 раз выше,, Результаты этого исследования, которое продолжалось в течение 110 недель, и покрыта два поколения, показал отсутствие какого-либо неблагоприятного влияния на рост, вес органов, воспроизведение, тератогенного и канцерогенности. Только самки питались мясом управления телят, которые были добавлены ТВА в дозах в 25 раз нормальных, имели значительно более низкий рост (P <0,05). Биохимические константы в крови были такими же, в обеих группах.

Эти эксперименты показывают, что соединения природного стероида мужских и женских гормонов, и их производные, по всей видимости, без опасности для потребителя. Они полезны в животноводстве, устраняя ряд часто дорогостоящих и загрязняющих терапевтических операций. Напротив, использование DES-типа нестероидных анаболических средств имеет серьезные недостатки. Это трудно обнаружить их остатки в мясе. Результаты реле токсичности показывают, что анализ и биологическая поведение не согласен.

Неизбирательное запрещение всех видов анаболических средств может быть приводит к использованию DES и аналогичных веществ. Анализы мочи, в которых они могут быть идентифицированы наиболее легко, выявили их в 20% случаев. В Соединенных Штатах, Мак-Кланга (19) считает, что 500 000 коров лечат незаконно. В Европе, незаконное использование представляется достаточно общий, но имеет тенденцию к снижению. Использование DES и аналогичных веществ, таким образом, должна быть запрещена, в то время как стероиды и их производные должно быть разрешено в соответствии с ветеринарным контролем. Это было мнение многих писателей еще в 1967 году, и их выводы были подтверждены Объединенного комитета ФАО / ВОЗ 1975 (2) и недавний международный симпозиум (Варшава, 27-30 апреля 1980 года) (9). Любой новый анаболический агент должен быть строго проверены, прежде чем он широко распространен.

Существует необходимость в разработке практических, экономических и быстрые - но очень точным - методы обнаружения остатков, особенно те, которые происходят в продуктах химически отличается от природных стероидных гормонов и их производных.

3. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ уровень гормонов в животноводстве ТОВАРЫ

Следует четко понимать, что это обсуждение касается только методы измерения предназначен для обнаружения остатков, остающихся в плоти и внутренностей. Эти методы, однако, не очень надежны, и другого биологического материала должны быть исследованы, чтобы определить, были ли лечить животных. Специалисты считают, что еще есть трудности в тестировании для остатков в тканях животных, предназначенных для использования в качестве продовольствия.

Многие различные методы были предложены и обсуждены на уровне EEC. Хотя тенденция все больше и больше в сторону использования радио-иммунологического анализа, нельзя отрицать, что методы являются очень сложными и до сих пор далеко от совершенствуются.

DES и аналогичные вещества должны предпочтительно искать в мочой и калом. Инструкции на этот счет были выпущены в США в 1979 году и подтверждена в 1980 году (48).

Следует также принимать во внимание тот факт, что нет никакой разницы, можно найти между животными должным имплантированных анаболические средства, и необработанных животных. Эта проблема получила недостаточное внимание. Материалы Совместного совещания ФАО / ВОЗ марта 1975 (2) содержат отчеты, подчеркивающие этот недостаток разницы и относительно высокие, но физиологические, уровень тестостерона и прогестерона в плоти быков и коров, супоросных соответственно. В таком случае, как можно естественным присутствие этих веществ следует отличать от их присутствия в связи с использованием натуральных продуктов?

Кроме того, не следует забывать, что очень многие кормов для животных содержат фитогормоны, которые могут вызвать изменения в морфологии и гистологии отдельных органов.

После подведения итогов и заявив, принципы четырех основных групп полезных методов, перечисленных Крус и др. (39) и Richou-Бак и Пантелеимон (42) - гистологическое, биологические, физико-химические и радиоиммунологическая методы - эта статья подробно изучить методы, которые могут быть применены на практике в течение текущего контроля.

1. Гистологические методы (Крус и др. (39)), используется специально в молодых коров, состоят в наблюдении изменения в мужских и женских половых органов. Простата и бульбо уретры желез особенно рассмотрены в мужских телят и ягнят, в то время как у женщин внимание сосредоточено на желез Бартолин, сосков, влагалища и шейки матки.Изменения очевидны, когда DES и зеранол, а также гексоэстролацетат, были использованы. У свиней эффекты менее заметной. Это, как правило, согласились, что гистологический метод позволяет сделать вывод, что эстроген был использован в какой-то более раннее время. Использование природных эстрогенов стероидных, в комбинации с тестостероном или прогестерона, приводит лишь к небольшим гистологических изменений. Фито-эстрогены могут также иметь некоторое влияние и привести к изменениям; В этом случае из Fusariuminfected кукурузы.
2. Биологические методы, используемые в тех Astwood (26), который измеряет увеличение матки весом до половозрелых мышах и крысах, и Аллен и Дуази (25), на основе модификаций цитологии влагалища взрослых мышей после ovarectomy, Последнее испытание, применяются Стоб др. (47) в 1954 году, является наиболее чувствительным, но реагирует только соединений с эстрогенной активности. Martin (40) сообщает, что использование концентрированных экстрактов помещается во влагалище мышей также дает хорошие результаты.
3. Физико-химические методы, которые позволяют идентифицировать себя с точностью анаболический агент искал, требующие довольно долго добычу, а затем тонким слоем или газообразного хроматографии. Hans и Abraham (31) сообщают, что последние методы, в сочетании с масс-спектрометрией, теперь могут быть рассмотрены. Высокая чувствительность. Кроме того от это возможно использование жидкого / жидкостной хроматографии. Тонкослойная хроматография в настоящее время используется, и Вербеке дает подробности в документе EEC (50), в то время как Вальдшмидт (52) и Шуллер и Stephany (46) описали метод.
4. Радиоиммуноанализа, впервые описанный для эстрогенных стероидов Jiang и Райана (38), основан на конкуренции между меченных тритием и немаркированных антигенов для соответствующих специфических антител. Эта методика, все шире используется, обладает высокой чувствительностью, что позволяет обнаружить 0,05 до 0,005 частей на миллиард DES и 0,1 частей на миллиард ТВА. Это, однако, сложный и длительный, хотя улучшается. Он имеет те же преимущества, как и все использования радиоактивных соединений. Методика была хорошо изучена Гофмана (34) и Гофмана и Карг (35).

Два новых методов также могут быть упомянуты: жидкостной хроматографии высокого давления, который, в соответствии с Richou-Бак и Пантелеимон (42), кажется, не быть достаточно чувствительным, и так называемый метод Элиза, применяется Ruitenberg др. (44) в Нидерландах для обнаружения инфекции свиней трихинелл Spiralis. Этот метод, который использует фермент для маркировки, с последующим измерением с 450 нм спектрофотометрии, требует дальнейшего развития, но это может быть возможным автоматизировать ее использование. Крус, работая на Билтховене (Нидерланды) изучает, как он может быть использован для измерения уровня гормонов.

Таблица I, завершена от оригинала любезно предоставленную Richou-Бак, указывает на чувствительность всех этих новых методов.

Таблица I. Чувствительность методов для тестирования
для "гормонов" и анаболических агентов
(частей на миллиард)

Вещество	Радио-иммунологический	Тонкослойная хроматография	Биологическая	Другие
Мышца	Печень	Моча	Плазма	Мясо	Моча	Фекалии	Эствуд	Гистология (простаты)
DES	0,05-0,09	0,05-0,09		0,2	От 0,5 до 20			5 (устно)	+ + + +	Высокое давление
Гексоэстролацетат	0.04			0.03	От 0,5 до 80			-	+ + + +	жидкостной хроматографии
Dienoestrol	-	-		-	От 0,5 до 40			-	+ +	Методом ИФА
Этинил-эстрадиол	-	-		0.02	От 4 до 40				+ + + +
Зеранол					3 до 80			+ (Подкожно)	+ + + +
Зеараленон
Эстрадиол 17β-	<0,05	<0,05	0,1	0.02					+ +
Эстрадиол-17α	-	-		0.02	0,5			?	?
Эстрон	≤0.5	≤0.5		0.02					+
Эстриола	От 0,05 до 1	От 0,05 до 1		-
Эстрадиол 17β-
+ Прогестерон
									+ +
Прогестерон	?	?		0,05
					(От 1 до 10
Medroxy-прогестерон
α-метил orβ
прогестерон					От 2 до 10
Тестостерон	?	?	≤0.02	≤0.02	От 2 до 8
19-нортестостерона				0.02
Метил тестостерон				-	От 0,5 до 4
Тренболон	0,1	0,1		0.02	От 0,2 до 10
Тренболон + эстрадиол-17β									+
1-6 или 5 Dehydrotestosterone					С 1 по 3

Рисунок A	Рисунок B
Источник: Вербеке (50)	Источник: Вербеке (49)

Рисунок C

МОЧИ

(Образец: 20 мл, разбавляют 10 мл _H 2 O)
↓
Гидролиз
↓
Эфир добыча и промывка эфирной фазы
↓
Колонке с силикагелем
↓
Элюат выпаривали в атмосфере N
и собираются в мкл ацетона
↓
HPTLC (bidim.) *
↓
Наблюдение в УФ-366 нм
(розовое пятно показывает наличие DES)

Источник: французские ветеринарные услуги.

* Высокая эффективность тонкослойная хроматография (двумерная).

На практике, появляется наиболее актуальной проблемой, чтобы быть обнаружение DES. Бори и др. (27) и другими авторами, показали, что он выводится с мочой и калом. Это также было продемонстрировано (30), что слюна не содержит DES но он содержит прогестерон. DES не может быть обнаружен в плоти животных, получавших три недели до убоя.Это могут быть обнаружены в моче после одного месяца по тонкослойной хроматографии и радиоиммуноанализа.

Мочевой пузырь должен содержать только от 20 до 50 мл мочи для тонкослойной хроматографии метод должен быть применен. Метод, используемый в 1973 (29) для обнаружения остатков эстрадиола, был изменен и улучшен Вербеке (50) в 1979 году Фогт и Oehrle (51) использовали его для обнаружения остатков стероидных эстрогенов и стильбеновый в моче телят. Райан и Хоффман (22) использовать его вместе с радио-иммунологического анализа, для изучения связанных остатков тренболон.

Для последнего соединения, в соответствии с Richou-Бак и Пантелеимон (42), Шуллер и Стефани считает возможным использовать тонкослойной хроматографии, чтобы достигнуть уровня чувствительности 0,005 частей на миллиард, сравнимой с радиоиммуноанализом; этот показатель не был включен в таблице I.

Цифры А и В показывают, соответственно, излагаются аналитических методов Вербеке для мяса, жира и внутренних органов, а также для мочи (49, 50). Рисунок С показывает очертания техники для мочи используется в лабораториях французской ветеринарных услуг для обнаружения DES.

Радио-иммунологический на основе конкуренции между меченых антигенов и немаркированных, т.е. меченый гормон (указано ниже, Н *) и непомеченного гормона (H), для той же молекулы антитела. На рисунке ниже показан процесс реакции.

Н * (Меченного тритием гормона)

+

Б. (Конкретные анти-тела)

Н * - А.Б. (Локализованная помечены гормон)

+
(Стандарт или
Н * (биологический

(Меченного тритием гормона)

(Локализованная немеченое гормон)

Уровни АВ и Н * постоянна, любое увеличение H вызывает снижение меченого гормона, локализованного в специфическое антитело (H * - AB). Измерение, создана путем расчета отношения

зависит от измерения уровней радиоактивности между локализованными меченого гормона и свободного гормона.

Крус и др. (39) и Richou-Бак и Пантелеимон (42) дают подробную информацию о методах добычи и измерений. Гофман и Laschuetza (37) использовали метод для изучения плазмы крови и плоти DES.

Гормон оказывает антигенной локализацией на сывороточные белка. Маркировка гормон ни в коем случае изменения молекулы. Специфичность иммунологического зависит от внутренних характеристик антитела и эффективности способа очистки гормона. Многие методы существуют для разделения свободного H *, но иммунопреципитацию, кажется, метод используется наиболее часто. Иммунологический поведение гормона, присутствующего в своей матрице должны быть одинаковыми с эталонного стандарта.

Авторы, такие как Exley соавт. (28), Гофман и Karg (35) и Heinritzi (32) использовали этот метод для естественных эстрогенов, Авраам и др. (24) и Rombauts др. (43) для DES и др Pottier. (41), Heitzman и Харвуд (33) и Гофман и Oettel (36) для TBA.

Это еще не ясно, что методы являются наиболее точным и экономичным, и поэтому практически для масштабного контроля.

Основной материал, который может быть проверен также должна быть определена.

Флеш, жир и внутренние органы, не могут быть использованы для DES, который может быть идентифицирован только в моче, с чувствительностью около 6 частей на миллиард.Многие анализы могут быть сделаны с помощью тонкослойной хроматографии и радиоиммуноанализа. Французские службы контроля использовать только бывший, оценивая стоимость одного анализа на 25 франков (= ок. США 5 $). Возможность методов, применимых к плоти находится в стадии изучения, но в этом отношении методы говорить о «химической пыток". Они признают, что текущий контроль мяса для всех гормонов, кажется, трудно.

Те же услуги также использовать мочу для измерения естественных гормонов, применяя технику Вербеке (50). Результаты не получаются из плоти, даже для естественных гормонов, в течение 3 недель после обработки, уровень слишком низкий. Таким образом, по сравнению с необработанными телятами, доходности тонкослойной хроматографии никакой информации.

Столы с 1 по 4 в ссылке. 50 показывают уровни чувствительности для различных гормонов, в соответствии с системой используемого растворителя, как определено Вербеке, а также значения РЧ и дополнительные цвета под воздействием УФ-флуоресценции при длине волны 366 нм.

Это может сделать вывод, что процедура управления во плоти очень трудно во всех случаях, независимо от анаболических агентов. Прежде всего, использование DES следует избегать, и для этой цели, используя мочу в качестве основного материала, высокая производительность двухразмерным тонкослойная хроматография является методом более предпочтительным.

Дата добавления: 2015-11-14