Физико-химические основы технологии

Биосе́нсор — это аналитический прибор, в котором для определения химических соединений используются реакции этих соединений, катализируемые ферментами, иммунохимические реакции или реакции, проходящие в органеллах, клетках или тканях.

В биосенсорах биологический компонент сочетается с физико-химическим преобразователем.В результате реакции между биологическим материалом и субстратом происходят изменения, которые с помощью подходящего преобразователя превращаются в электрический сигнал. Это делается для того, чтобы улавливать изменение и отвечать на него, как это делают органы чувств животных. (Например, палочки и колбочки в сетчатке глаза являются преобразователями. В ответ на действие света они образуют нервный импульс, который имеет электрическую природу.) Для того чтобы электрический сигнал биосенсора можно было считать в той или иной форме, например на цифровом табло, применяется усилитель сигнала. Биосенсор дает возможность улавливать различные типы изменений, такие как высвобождение тепла, свет, изменения рН или массы, поток электронов или образование новых химических веществ.

Преимущества и проблемы использования биосенсоров

Основные преимущества биосенсоров:

1) биосенсоры специфичны — можно анализировать сложные смеси на присутствие определенного химического вещества без предварительной очистки;

2) они очень чувствительны, поэтому можно обнаружить очень низкие концентрации вещества в очень малых образцах;

3) они дают быстрый ответ;

4) они безопасны для использования;

5) они точны;

6) они могут быть очень маленькими;

7) они доступны для массового производства.

Основные недостатки биосенсоров:

1) они не очень прочны, поэтому нуждаются в тщательном уходе;

2) они не очень стабильны;

3) их нельзя стерилизовать.

Биосенсоры состоят из трёх частей:

1) биоселективного елемента (биологический материал, например ткани, микроорганизмы, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, антитела, нуклеиновые кислоты, и т. д.), материал биологического происхождения или биомимик). Чувствительный элемент может быть создан с помощью биоинженерии.

2) преобразователя (работает на физико-химических принципах; оптический, пьезоэлектрический, электрохимический, и т. д.), который преобразует сигнал, появляющийся в результате взаимодействия аналита с биоселективным элементом, в другой сигнал, который проще измерить;

3) связанная электроника, которая отвечает в первую очередь за отображение результатов в удобном для пользователя виде.

Самый известный пример коммерческого биосенсора — это биосенсор для измерения уровня глюкозы в крови, в котором используется фермент глюкозоксидаза для расщепления содержащейся в крови глюкозы. В процессе расщепления фермент сначала окисляет глюкозу и использует два электрона для восстановления ФАД (компонент фермента) в ФАДН2, который, в свою очередь, окисляется в несколько ступеней электродом. Результирующий ток пропорционален концентрации глюкозы. В этом случае, электрод является преобразователем, а фермент — биоселективным элементом.

С недавних пор, массивы из многих различных молекул детектора применяются в так называемых электронных носах, где наборы откликов от детекторов используются для определения веществ. Современные электронные носы, тем не менее, не используют биологический материал (то есть являются хемосенсорами).

Многие из современных биосенсоров используют организмы, которые реагируют на значительно меньшие концентрации токсических веществ, чем это делает человек, предупреждая таким образом о присутствии яда. Эти приборы могут использоваться для экологического мониторинга, определения незначительных примесей нефтепродуктов и на сооружениях для очистки сточных вод.

Классификация биосенсоров

В зависимости от типа преобразователя, биосенсоры классифицируют на оптические, акустические, калориметрические, термические и электрохимические. Электрохимические биосенсоры, в свою очередь, делят на потенциометрические, амперометрические и кондуктометрические.

Оптические биосенсоры

Значительная часть оптических биосенсоров основаны на явлении поверхностного плазмонного резонанса и используют свойство золотых и других материалов, а именно то, что тонкий слой золота, нанесенный на имеющую высокий коэффициент преломления стеклянную поверхность может абсорбировать лазерный свет, создавая электронные волны (поверхностные плазмоны) на золотой поверхности. Это происходит только при определенном угле падения и длине волны падающего света и в такой степени зависит от поверхности золотого слоя, что присоединение аналита к биологическому рецептору на поверхности этого слоя генерирует заметный сигнал. Сенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса представляют собой сенсорный чип, который состоит из пластиковой кассеты, несущей стеклянную тарелку, одна сторона которой покрыта микроскопическим слоем золота. Эта сторона взаимодействует с оптической распознающей аппаратурой прибора. Противоположная сторона тарелки соединяется с жидкостной проточной системой. Растворенные в жидкости реагенты могут непосредственно контактировать с поверхностью тарелки. Эта сторона стеклянного сенсорного чипа может быть различными путями модифицирована, позволяя легко присоединять интересующие молекулы. Обычно она покрыта карбоксиметилдекстраном или подобным веществом.

Свет с фиксированной длиной волны отражается от покрытой золотом стороны чипа под углом полного внутреннего отражения, и детектируется внутри прибора. Этот свет индуцирует исчезающую волну, которая проникает сквозь стеклянную тарелку в раствор вблизи её поверхности.

Коэффициент преломления проточной стороны сенсорного чипа прямо влияет на поведение света, отраженного от покрытой золотом стороны. Связывание веществ с поверхностью проточной стороны чипа влияет на коэффициент преломления, что можно зарегистрировать оптической аппаратурой; таким образом биологические взаимодействия могут быть измерены с высоким уровнем чувствительности.

Другие биосенсоры на основе исчезающей волны были коммерциализированы с использованием волноводов, в которых константа распространения света через волновод изменяется при абсорбции молекул на поверхность волновода. Например, в двойной поляризационной интерферометрии используются два волновода, один из которых изолирован и является эталонным, а второй волновод непосредственно контактирует с исследуемым образцом. Сравнивая константы скорости распространения света в обоих волноводах, делают заключение о концентрации аналита.

Другие оптические биосенсоры основаны в основном на изменении в абсорбции или флуоресценции соответствующего индикаторного компонента и не нуждаются в полном внутреннем отражении. Например, разработан полностью функционирующий прототип прибора для определения казеина в молоке. Прибор основан на обнаружении изменений в абсорбции золотого слоя. Широко используемый в молекулярной биологии исследовательский инструмент, ДНК-микрочип, может также считаться оптическим биосенсором.

Электрохимические биосенсоры

Первое упоминание об аналитических устройствах на основе ферментов или ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х годах нашего столетия. Затем в обиход вошло понятие "биосенсор" или "биочип". Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально, таким образом, биосенсоры сопоставлены с датчиками живого организма – биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические.

Электрохимические биосенсоры обычно основаны на ферментативном катализе реакции, в которой освобождаются или поглощаются электроны (используемые ферменты принадлежат к классу оксидоредуктаз). Биосенсор обычно включает в себя три электрода: электрод сравнения, рабочий и вспомогательный. На поверхность рабочего электрода наносят биологический материал, который специфически вступает в реакцию с аналитом. Заряженные продукты реакции создают на рабочем электроде потенциал, который отнимается от потенциала на электроде сравнения для получения выходящего сигнала. Применяется также измерение силы тока (в этом случае интенсивность потока электронов пропорциональна концентрации аналита) при постоянном потенциале или потенциал можно измерять при нулевой силе тока (это даёт логарифмический отклик). Нужно отметить, что на потенциал электродов влияет заряд их окружения. Прямое электрическое определение небольших пептидов и белков по характерному для них заряду, используя биологически модифицированные ион-селективные полевые транзисторы (ИСПТ).

Другие типы биосенсоров

В пьезоэлектрических сенсорах используются кристаллы, которые эластически деформируются при воздействии на них электрического потенциала. Переменный потенциал при определённой частоте вызывает стоячую волну в кристалле. Эта частота в значительной степени зависит от эластичных свойств кристалла, поэтому, если кристалл покрыт биологическим распознающим элементом, присоединение большого количества аналита к рецептору приведет к изменению резонансной частоты, что и служит сигналом о связывании.

Термические и магнитные биосенсоры практически не распространены.

Использование биосенсоров в медицине.
В настоящее время биосенсоры широко применяются в медицине. Ферменты все больше используются для обыденного автоматизированного анализа содержания метаболитов, лекарств и гормонов в биологических жидкостях человека. Это особенно необходимо для клинической диагностики. Благодаря использованию биосенсоров, риск ошибок при постановке диагноза становится значительно ниже, а также уменьшаются затраты, поскольку биосенсоры широко распространены и доступны. Диагностика с помощью биосенсоров позволяет врачам-терапевтам проводить анализы непосредственно в их кабинетах, не прибегая к услугам лабораторий. При этом экономятся деньги, и отсутствует потребность повторно приходить к врачу за диагнозом. Кроме того, можно быстрее начать лечение. Еще одно преимущество состоит в том, что труднее перепутать, потерять или загрязнить пробу. Это особенно важно при анализах на содержание допинга у спортсменов. Полицейские и врачи уже используют специальные наборы для выявления небольших количеств наркотиков в крови людей.

Уже используются биосенсоры, позволяющие контролировать появление опасных метаболитов в ходе хирургической операции. Подобный контроль уровня метаболитов может стать обычным при использовании миниатюрных имплан-татов, которые могли бы немедленно исправлять ситуацию, если появляются какие-либо изменения. На основе «биочипов» можно создать более чувствительные биосенсоры меньшего размера. Точно так же, как использование силиконовых микрочипов привело к уменьшению размеров компьютеров, использование полупроводниковых органических молекул вместо силикона приведет к дальнейшему уменьшению размеров биосенсоров. Электрический сигнат сможет проходить по этим молекулам, и электрическая цепь будет шириной в одну молекулу. Биочипы должны быть достаточно малы, чтобы их можно было имплантировать в тело человека. Тогда станут возможны такие устройства, как искусственные органы чувств и стимуляторы ритма сердца.

Применение биосенсоров в других областях

Другая большая область применения биосенсоров — контроль промышленных процессов. Живые клетки (дрожжи и бактерии), соединенные с электродами, применяются для измерения концентраций L-аминокислот, спирта, фенолов, метана, различных Сахаров, уксуса и антибиотиков. С их помощью контролируют условия внутри ферментеров, что особенно важно при непрерывном культивировании.

Разработана очень чувствительная система, позволяющая улавливать следовые количества кислорода. В этой системе использованы бактерии, которые начинают светиться в присутствии кислорода. Излучаемый свет регистрируется фотоэлементом. Огромный интерес вызывают оптические биосенсоры. Одна из причин такого интереса связана с возможностью использования волокнистой оптики для дистанционного зондирования в опасных условиях среды.

Многие ферментативные реакции сопровождаются выделением тепла. Термобиосенсоры регистрируют изменения температуры в 0,0001 °С. Их можно использовать для обнаружения молочной кислоты.

Предполагается, что в будущем биосенсоры будут применяться в сельском хозяйстве, ветеринарии, в качестве средств защиты человека (для обнаружения нервно-паралитических газов, токсинов и взрывчатых веществ) и окружающей среды (главным образом, для выявления загрязнений). Во всех этих сферах использования биосенсоров увеличивается ежегодно примерно на 30%. Однако рынок все еще мал; в 1992 г. он составлял менее 50 млн. фунтов стерлингов. Отчасти это связано с перечисленными выше недостатками биосенсоров.

Принцип работы биосенсора.

Определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, в котором и протекает ферментативная реакция. Поскольку в данном случае продукт ферментативной реакции определяется с помощью электрода, на поверхности которого закреплен фермент, то такое устройство еще называют ферментным электродом. И понятие «биосенсор» тождественно «ферментному электроду».

Характер ферментативной реакции зависит от природы фермента, типа его каталитического действия. Среди ферментов можно выделить оксидоредуктазы, осуществляющие реакции окисления и восстановления, гидролазы, катализирующие гидролиз, трансферазы, вызывающие перенос ацильных, гликозидных и других. остатков и т.д. Многие ферменты сейчас доступны, их чистые препараты включены в каталоги ряда фирм-производителей. Важно отметить, что при конструировании биосенсора увеличение продолжительности действия фермента становится основной задачей. Дело в том, что активный фермент сохраняет свои свойства лишь в течение относительно короткого времени. Поэтому была разработана операция так называемой иммобилизации фермента. В ходе иммобилизации с помощью специальных реагентов фермент "закрепляют" либо на поверхности адсорбентов, например силикагеля, угля или целлюлозы, либо вводят в пленку пористого полимера, либо ковалентно, то есть с помощью химических связей, "пришивают" к какой-либо подложке. При этом фермент закрепляется, перестает быть подвижным, не вымывается из биослоя, а его каталитическое действие сохраняется. Биосенсоры могут быть сконструированы и по так называемой объемной технологии, при которой индивидуальные компоненты составляют как бы единый физический ансамбль. Хотя такие биосенсоры в настоящее время и применяются на практике, они имеют недостатки, есть трудности и при их изготовлении. Послойное покрытие электрода или какого-либо твердого преобразователя мембраной должно быть воспроизводимо. Соответствующая технология формирования поверхности должна допускать возможность изготовления достаточно миниатюрного электрода. Биосенсоры со сравнительно толстыми мембранами дают в итоге большее время отклика, имеются сложности и при их градуировке. Успехи в области развития средств микроэлектроники подтолкнули разработчиков конструкций биосенсоров к новым решениям. Оказалось перспективным использовать так называемую планарную технологию (фотолитографию, полупроводниковую технику покрытий и т. д.), по которой можно изготовить так называемый биочип, объединяющий сенсорную систему, трансдьюсер, аналого-цифровой преобразователь и микропроцессор для измерения аналитического сигнала и расчета результатов анализа. Но основной проблемой в данном случае будет являться воспроизводимость состояния, то есть микроструктуры поверхности с нанесенным слоем биологически активного фермента. Трудной задачей представляется в данном случае и оптимизация такой структуры в отличие от объемной технологии, реализованной присутствием в конструкции сенсорной части нескольких молекулярных слоев. Тем не менее "молекулярный дизайн" при конструировании биосенсоров будущего может составить реальную конкуренцию объемному их варианту.

Рисунок 1.2 – Принципиальная схема действия биосенсора

На первом этапе действия биосенсора происходит «узнавание» биоэлементом специфического для него вещества из многокомпонентной смеси. На второй стадии происходит преобразование информации о протекании биохимической реакции в форму электрохимического сигнала. На последней стадии электрический сигнал от трансдьюсора преобразуется в пригодную для обработки форму. Наиболее представительным типом биосенсоров являются электрохимические биосенсоры. На рабочем электроде задается постоянный потенциал относительно электрода сравнения. Наблюдаемый ток оказывается пропорциональным либо объемной концентрации электроактивных частиц, либо скорости их расхода в биокаталитическом слое.

1) графитный электрод

2)активный слой вспомогательного

электрода (Ag/AgCl)

3) ферментный рабочий электрод

4) пассивирующее покрытие

Развитие биосенсоров обещает множество новых открытий в разных отраслях. Параллельное совершенствование микро- и наносистемной техники и сенсорных технологий приведет к созданию внедрению микроаналитических систем, это позволит перейти на новый уровень миниатюризации оборудования и точности измерений.

Распознающий элемент биосенсора находится в непосредственном контакте с исследуемым образцом, именно он отвечает за химические и биохимические реакции, протекающие в процессе анализа. Наиболее универсальным направлением развития являются биосенсоры, использующие антитела, т.к. могут быть изготовлены для связывания чрезвычайно широкого класса веществ. С точки зрения экономичности подают большие надежды клеточные биоиндикаторы, технологии создания которых стремительно развиваются. На очереди создание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволит создать "искусственные органы" обоняния и вкуса, а также применить указанные разработки для возможно более точной и информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых открытий

Биосенсоры можно включить в список высокотехнологичных устройств, которые в настоящее время активно разрабатываются и в ХХI веке будут широко внедрены. В этот список входят микро- и нанороботы, молекулярные запоминающие устройства, одномолекулярные транзисторы, «умные» стекла и другие научные достижения, которые еще недавно казались фантазией, и на наших глазах становятся реальностью.

Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты – высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. Каталитическая активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных катализаторов, ферменты увеличивают скорость реакции в 10³-10⁷ раз. Классический пример биосенсора, использующего ферментативный рецепторный слой это амперометрический сенсор на глюкозу с глюкозооксидазой.[6]

Продуцентами глюкозооксидазы являются различные грибы: Aspergillus niger, Penicillium notatum, Penicillium glaucum, Penicillium amagasakiense и Penicillium purpurogenum. Фермент A. niger наиболее хорошо изучен, и на сегодняшний день активно ведутся разработки в области повышения выработки ферментов этой культурой. A. niger имеет молекулярную массу 160000 и содержит две ФАД - единицы. При его обработке β-меркаптоэтанолом происходит разрыв дисульфидных связей и образуются две субъединицы с молекулярной массой 80000. Содержание углевод составляет 16%. Позже было подтверждено, что молекула фермента из A. niger содержит две ФАД-единицы, и из очищенного препарата было выделено шесть фракций, имеющих изоэлектрические точки рН от 3,9 до 4,3, которые, как было установлено, иммунологически подобны. Аминокислотный состав фермента приведен ниже.

Таблица 1.2 – Аминокислотный состав глюкозооксидазы

Лизин	35,9	Алании	134,2
Гистидин	31,3	Цистейн	4,6
Аргинин	47,5	Валин	92,5
Аспарагиновая кислота	149,5	Метрионин	26,0
Треонин	84,0	Изолейцин	52,1
Серии	78,5	Лейцин	103,0
Глутаминовая кислота	108,0	Тирозин	53,0
Пролин	57,9	Фенилаланин	37,0
Глицин	118,5	Триптофан	15,8

Однако установить, какие заряженные группы связаны с белком, не удалось. Обычно это С-концевая аминокислота, например Ala—Met—Glu—СООН, а не N-концевая аминокислота, которая маскируется и не может быть определена. Поэтому и сейчас продолжаются исследования по изучению ее свойств ГОД характеризуется высокой стабильностью в щелочной зоне рН. Даже при рН 11,0 и 12,0 фермент в течении 24 часов сохраняет 62 и 57% активности, соответственно. Изучение температурной стабильности ГОД показывает, что при 40 ⁰С после часовой выдержки фермент сохраняет 84,5% исходной активности, а при 50 ⁰С – 55%.

Вся работа датчика основана на протекании двух основных реакций, протекающих по схеме

(1.1)

(1.2)

ГОД отщепляет от глюкозы водород и переносит его на кислород, который окисляется до перекиси водорода. Образовавшийся в результате отщепления водорода продукт взаимодействуя с влагой крови, моментально образует глюконовую кислоту. Эта реакция также представляет практический интерес с позиции получения глюконовой кислоты.

В свою очередь ферроцен под действием перекиси водорода легко и обратимо окисляется до катион-радикала ферроцения.При одном акте реакции выделяется один электрон. Количество образовавшихся электронов пропорционально концентрации глюкозы в крови.

Для осуществления данных реакций в пределах биоэлектрохимического датчика фермент глюкозооксидазу (ГОД) необходимо иммобилизовать на инертном носителе. Но активный центр восстановленной глюкозооксидазы не окисляется на металлических или углеграфитовых электродах. Поэтому для осуществления биокаталитического окисления глюкозы необходимо наличие медиатора, в качестве которого и выступает ферроцен. Модифицированные медиаторам электроды получают путем адсорбции или электроосаждения низкомолекулярных соединений на стеклоуглеродном электроде. Другие модифицированные электроды (МЭ) получены путем адсорбции высокомолекулярных соединений, содержащих редокс группы.

Иммобилизованными называются ферменты, движение в пространстве которых ограничено полностью или незначительно.Иммобилизация обычно воплощается в придании ферменту формы, которая нерастворима в воде и которая представляет по ряду причин большой практический интерес.

Известно много методов приготовления иммобилизованных форм ферментов и других белковых продуктов. В течение последнего десятилетия они определялись как водонерастворимые ферменты, нерастворимые ферменты, ферменты, заключенные в матрицы, и как ферменты, помещенные в массу геля.

В анализаторах, предназначающихся для определения глюкозы, применен глюкозооксидазный ферментный электрод.

Принцип его действия основан на протекающей в присутствии кислорода специфической реакции, катализируемой ферментом глюкозооксидазой.

(1.3)

Количество связанного кислорода или образовавшейся перекиси водорода пропорционально содержанию глюкозы в исследуемом растворе.

За ходом реакции удается следить путем регистрации (с помощью амперометрических датчиков) скорости образования перекиси водорода или потребления кислорода.

Действие базовой модели анализатора и его модификации основано на электрохимическом определении продуктов ферментативной реакции окисления глюкозы. В качестве селективного элемента применяется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованный в полупроницаемой мембране.

Дата добавления: 2015-11-14