Вимірювання активності APX

Вимірювання проводять у день проведення досліду, так як під час зберігання екстракту ферменти змінюють свою активність.

1. Готується реакційний буфер (для визначення активності APX).

Для визначення активності APX у тканинах шлунка + кишечника, голови та грудей (50 мл буферу) [13, 28]:

· 5 мл 1M NaPH

· 125 мкл 1M AsA

· 1500 мкл 1M H₂O₂

· 43,375 мл H₂O

3. Усі реактиви слід постійно тримати у охолодженому штативі. Якщо не виконується робота із екстрактами, їх слід помістити у холодильну камеру.

4. Вимірювання проводиться за допомогою спектрофотометра (СФ-46). Обов’язково вмикають прилад за 15-20 хвилин до роботи із ним. Довжина хвилі для вимірювання активності APX – 290 нм.

5. У одну кювету додається 1 мл приготовленого заздалегідь реакційного буфера. У другу кювету додають кількість буферу, яка залежить від кількості взятого екстракту (разом 1 мл). Кювети поміщаються у прилад. Далі його налаштовують до отримання оптимальних значень. Перед вимірюванням у дослідну кювету додають екстракт та 100 мкл аскорбату і добре перемішують суміш у кюветі. Перед додаванням екстракту засікають час. Перемішують до 7 секунд, після чого швидко закривають прилад, та відкривають шторку приладу. Вимірюють перше значення на 10 секунді. Надалі фіксують значення кожні 30 секунд.

6. Активність аскорбатпероксидази вимірювалась як мкМ окисленого аскорбату на хвилину на мг білку використовуючи коефіцієнт екстинції 2,8 мМ-1 * см-1 [12, 28].

Дата добавления: 2015-07-12