Методика підготовки тканин імаго бджоли медоносної A.mellifera до вимірювання активності ферментів

1. Бджіл привозили з пасіки та поміщали у садок. Садок поміщають у термостат із температурою 22-23 ̊̊ С.

2. Після цього, безпосередньо у день проведення експерименту, бджіл у садку поміщають у холодильник на 10-15 хв, для припинення активності.

3. Надалі бджіл виймають із холодильника, і відбирають пінцетом, при цьому притискаючи груди бджоли (до характерного легкого хрусту), за рахунок чого вона знерухомлюється [6].

4. Для виготовлення супернатанту, який використовується для вимірювання активності асккорбатпероксидази (APX) відбираємо кишечники з шлуночками, голови та торакси з 10 бжіл, а як буферний розчин використовували 100мМ NaPH (pH 7.0), який містив 2,5мМ аскорбат [28].

5. Після того як бджолу знерухомили, її кладуть боком на стіл, злегка притискаючи пінцетом. Другим пінцетом у цей час відділяють останній жалоносний сегмент черевця, і разом із ним витягають із бджоли кишечник та шлунок.

6. Далі бджоли без шлуночків та кишечників переміщують у пробірки та занурюють в рідкий азот.

7. Кожен витягнутий кишечник та шлунок очищується від грубих неперетравлених залишків, після чого поміщається у епендорф із буфером для кишечників та шлунків.

8. Далі епендорф із буфером, в якому знаходяться шлунки та кишечники центрифугують 10-15 хвилин при 350 G, для остаточного очищення матеріалу.

9. Відбирають рідину з епендорфу, та зважують наважку кишечників із шлунками.

10. Із бджіл, що були занурені в рідкий азот, відчленовуються говолови та торакси за допомогою пінцета і поміщаються у епендорфи.

11. Далі кишечники із шлунками, голови та торакси гомогенізують, додаючи у 5 разів більший об’єм NaPH буфера.

12. Після цього розчини кишечників із шлунками, голів та тораксів центрифугують 10 хвилин при 12000 g.

13. Відбирають супернатант у чисті епендорфи, і поміщають у холодильник, або зразу вимірюють активність ферментів.

Дата добавления: 2015-07-12