Обсуждение результатов

На стадии металл-аффинной хроматографии по хроматограмме определяли, что исследуемый белок pkb 5 содержится в фракциях 31 и 32.

Рис..Хроматограмма выделения каталитического домена pkb 5

Далее определяли количества исследуемого образца по методу Брэдфорд и рассчитывали концентрацию pkb 5 (таблица).

№ пробы	Оптическая плотность	Количество в 5 мкл, мкг	Концентрация, мкг/мкл
	0,758
	0,513		1,8

Фракции 31 и 32 объединяли, так как в них содержиться исследуемый белок.

Так как каталитический домен pkb5 выделялся в денатурирующих условиях, для дальнейшего исследования было необходимо провести рефолдинг этого белка.

На следующем этапе объедененные фракции диализовали для рефолдинга pkb5 из денатурирующих условий в нативные условия.

На следующей стадии для проверки оптимальных условий хроматографической очистки pkb5 различных фракций, провели электрофоретическое разделение белков в денатурирующем SDS- полиакриламидном геле.

Рис. Электрофореграмма полученная в результате очистки pkb5; а) 1- лизат, 2- фракции 13-20, 3- фракции 26-27, 4- фракция 31, 5- исследуемый образец после диализа, 6- маркерные белки (Prestained Protein Molecular Weight Marker, 20-120 kDa); б) 1- лизат, 2- фракции 13-20, 3- фракции 26-27, 4- фракция 31, 5- маркерные белки (Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa), 6- исследуемый образец после диализа

В таблице (..) указано конечное количество белков наносимое на электрофорез.

Таблица(..)

№ пробы	Лизат	Фракции 13-20	Фракции 26-27	Фракция 31	Исследуемый образец после диализа
Количество, мкг

На следующем этапе после ступенчатого диализа увеличивали концентрацию исследуемого белка pkb 5 для дальнейшего измерения активности.

Ранее была проведена проверка фосфотрансферазной активности каталитического домена pkb5. Сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов с.н.с., к.т.н. Мавлетовой Д. А. и м.н.с. Мирончевой Т. А. ИОГен им. Н. И. Вавилова Ран было проведено автофосфорилирование каталитического домена pkb5 с использованием [γ-32P]-ATP (рис).

а) б)

Рис. а) Электрофореграмма автофосфорилирования pkb5. б) Авторадиограмма автофосфорилирования pkb5

Проверка активности

Реагент Kinase-Glo использует остаточное количество АТФ как субстрат для Ultra-Glo^TMLuciferase, катализируя монооксигенацию люциферина, с образованием фотона света (рис. 1). Активность протеинкиназы обратно пропорциональна интенсивности сигнала люминесценции.

Рис. 1. Схема реакции Kinase-Glo® Assey

По люминесцентным данным построен график зависимости процента автофосфорилирования от количества протеинкиназы pkb 5 (рис.).

Рис. Процент автофосфорилирования pkb 5

Дата добавления: 2015-10-21