Практическая работа

Тема занятия: «Культуральный метод диагностики микозов»

Цель занятия: отработать методику культурального метода диагностики микозов

Самостоятельная работа:

1. Микроскопия музейных препаратов.

2. Посев исследуемого материала на среду Сабуро. КА, МПА с 2% глюкозой.

3. Изучение культуральных свойств грибов на питательных средах.

4. Посев чистой культуры грибов на сахарный ряд (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза) и на среду с мочевиной.

Методические указания к практической работе:

В качестве исследуемого материала при микозах используют соскоб кожи и слизистой оболочки, гнойное отделяемое, мокрота, ликвор, моча, фекалии, желудочный сок, фрагменты кожи и ее придатков (ногти, волосы), биоптаты и при летальных исходах образцы пораженных органов. Для выделения чистой культуры грибов исследуемый материал засевают на неселективные и селективные питательные среды. В качестве неселективных питательных сред используют агар Сабуро – пептонный агар с мальтозой (глюкозой). Эту среду отличает высокое содержание углеводов, ингибирующих размножение бактерий. В настоящее время среду не рекомендуют применять для первичного выделения возбудителей дерматофитий; при внесении левомицетина и циклогексимида применение агара Сабуро возможно. Кроме того, можно использовать сусло - агар, сахарный агар, картофельный агар, МПА, картофельно-декстрозный агар, агар Чапека-Докса, дрожжевой агар. Для выделения кандид используют голодный рисовый агар. Для выделения прихотливых патогенов, например Blastomyces dermatitidis и Histoplasma capsulatum в качестве обогащенных сред применяют 5-10% КА, дополненный сердечным и мозговым экстрактом, либо асцитический агар. Широкое распространение нашли ингибирующий плесневой агар (mold) и SAhHi- агар. В качестве селективных сред используют обычные неселективные среды, дополненные пенициллином (20ЕД/мл), стрептомицином (40ЕД/мл), гентамицином (0,5мкг/мл), левомицитином (6мкг/мл). Для ингибирования бурного роста плесеней, подавляющих медленно растущие диморфные грибы, в среды вносят циклогексимид (0,5мкг/мл). Следует помнить, что препарат подавляет рост некоторых патогенных грибов (например, Cryptococcuc neoformans и Aspergillus fumigatus).

После образования колоний грибов следует сделать пересев на простые питательные среды (картофельно-декстрозный агар или среду Сабуро), на которых можно выявить спороляцию возбудителя. РН питательных сред для культивирования грибов должна быть кислой- 4,0-6,5(большинство бактерий не растут в такой среде). При выделении грибов делают парные посевы, одни инкубируют при 25⁰С в хладотермостате, а другие – при 37⁰С. Рост грибов на перечисленных средах начинается с 3-5суток и продолжается в среднем 3-4 недели (характерные колонии формируются на 18-20 день). Эпидермофиты дают складчатые, бархатистые или мучнистые желтоватого цвета колонии. Одни трихофитоны на среде Сабуро формируют плотные, сухие, морщинистые с вдавленным центром, слегка припудренные белого или кремового цвета колонии, а другие – плоские, звездчатые с радиальными бороздами, кремовые с зернистой или порошковидной поверхностью (рост через 2-3 недели). Колонии С.albicans гладкие, выпуклые мягкой сметанообразной консистенции от белого до кремового цвета. На жидких средах С.albicans образуют рыхлый осадок на дне, бульон слегка мутный. С.tropiсalis дает морщинистые кожистые крошковатой консистенции колонии, цвет от белого до серого и кремового. На жидких средах при росте С.tropiсalis бульон мутный, на поверхности нежная серая пленка, переходящая на стенки, осадок в форме кольца. С.neoformans хорошо растет на обычных микологических средах, образуя типичные блестящие сочные колонии, опосредованные наличием полисахаридной капсулы. Из подозрительных колоний готовят мазки и окрашивают по Граму. Для некоторых грибов характерен диморфизм (морфологический полиморфизм), т.е. они могут быть мицелиальными (гифальными) или дрожжеподобными. Для обнаружения капсулы используют окраску индийскими чернилами. Для этого на предметное стекло необходимо нанести каплю индийских чернил, внести исследуемую колонию, перемешать и, накрыв покровным стеклом, микроскопировать на небольшом увеличении. Способность культуры к образованию капсулы проявляется наличием светлого четко очерченного ореола вокруг дрожжеподобной клетки на основном темном (за счет индийских чернил) фоне.

Идентификацию возбудителей проводят по морфологическим и биохимическим свойствам. Так, для дифференциации С.albicans и С.tropiсalis ставят пробу на уреазу: несколько однотипных по морфологическим признакам колоний дрожжевых грибов вносят в пробирку с уреазным бульоном (агаром) Кристенсена и инкубируют при 25-30°С до 4 дней (отрицательна для обоих видов); определяют ферментацию глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы (оба вида не ферментируют лактозу, но расщепляют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты - С.albicans, кислоты и газа - С.tropiсalis, не ферментирует сахарозу С.albicans, а С.tropiсalis дает разные варианты). Кроме того, производят посев культуры на среду с 0.1% циклогексимидом (актодионом) и инкубируют при 25°С в течение 48-72 часов (тест вариабелен для Candida spp). Широко используется для дифференциации кандид проростковая проба - тест на способность образовывать герминативные (проростковые или зародышевые) трубки. Несколько однотипных по морфологическим признакам колоний дрожжевых грибов вносят в пробирку с 0,5-1 мл сыворотки (кроличьей, бычьей, лошадиной, человеческой), термостатируют в течение 3 часов при 35±2С. По истечении инкубации готовят препарат (наносят каплю культуральной жидкости на предметное стекло, накрывают покровным стеклом) и микроскопируют при небольшом увеличении. Обнаружение в препарате зародышевых трубок (предшественников истинных гиф) свидетельствует о принадлежности дрожжевого гриба к C. albicans. 10-15% культур C. albicans, выделяемых из клинического материала не образуют зародышевые трубки при проведении данной методики. C.tropicalis формирует герминовые трубки с характерным сужением у основания, то есть в том месте, где они формируются из материнской клетки.

Можно использовать тест на способность кандид к формированию специфических репродуктивных структур или элементов мицелия.Тестируемую культуру засевают на кукурузный (рисовый) агар с твином 80, накрывают покровным стеклом и инкубируют при 25°С в течение 24-48 часов. По истечении инкубации чашку исследуют под микроскопом (20-кратном увеличении), обращая внимание на образование псевдогиф, истинных гиф, артроконидий и бластоконидий.

Псевдогифы – цепочки почкующихся клеток, размером напоминающие истинные гифы, формирующие ответвления и имеющие маленькие по размеру терминальные клетки. Гифы – трубчатые или нитевидные структуры грибов, способные формировать мицелий. Бластоконидии (собственно дрожжевые клетки), образуются вдоль гифы или псевдогифы в результате почкования. Артроконидии – это образующиеся при фрагментации гиф прямоугольные с закругленными концами или эллипсовидные участки.

Серологические исследования проводят для выявления специфических антигенов и антител. Часто могут быть сомнения из-за перекрестного реагирования антигенов с антителами различных грибов. Тем не менее, идентификация антигенов или циркулирующих антител в крови, СМЖ и моче позволяет установить диагноз до получения результатов посевов. Часто применяют реакцию латекс-агглютинации (выявление Ig M), РСК (Ig G) и иммуноферментный метод.

Кожные пробы ранее были одним из популярных методов диагностики микозов, однако их неспецифичность ограничивает диагностическую ценность. Их используют для анализа иммунных популяций при эпидемиологических исследованиях. Воспроизводят аллергические пробы по типу реакции Манту. Результаты их учитывают через 24-48 часов путем измерения зон гиперемии и инфильтрации.

Определение нуклеиновых кислот. Этот новый метод идентификации грибов разработан для определения основных возбудителей микозов, системных-бласто-крипто-кокцидиоидомикозов, а также гистоплазмоза. Для постановки реакции проводят экстракцию РНК из культуры и вносят одноцепочечные молекулы ДНК, меченные флюоресцеином. При наличии в культуре одного из четырех указанных возбудителей происходит гибридизация ответствующих ДНК с РНК-патогена с образованием легко обнаруживаемого комплекса. Основное достоинство метода – применение на ранних сроках (5 суток) в культурах, содержащих мицелиальные и дрожжевые формы.

Биопроба проводится путем инокуляции культуры и патологического материала, предварительно обработанного в течение одного часа антибиотиками (500 ЕД/мл) животным. Чувствительность экспериментальных животных к разным грибам неодинакова. Так, к кандидам чувствительны кролики и белые мыши, к дерматомицетам – кролики, морские свинки, крысы, к гистоплазмам, криптококкам – белые мыши и золотистые хомячки.

Основные морфологические и биохимические характеристики грибов рода Candida, наиболее часто встречающихся в клинической практике

организм	Морфологические свойства колоний на рисовом агаре при 25°С в течение 24-48 часов	Рост в бульоне Сабуро при 25-30°С до 5 дней	рост при 25°С с циклогексимидом	проростковая проба	уреазный тест	ферментация
глюкоза	мальтоза	сахароза	лактоза	трегалоза
C. albicans	псевдогифы с терминаль-ными хламидиоспорами; кластеры бластоконидий на септе	не образуют пленку на поверхности	+	+		+	+			+^V
C. tropicalis	бластоконидии вдоль псевдогифы	скудный пле-ночный рост с пузырьками				+	+	+^V		+^V
C. parapsilosis	бластоконидии вдоль закруглений псевдогифы; многократные разветвления с искривлением псевдогифы	не образуют пленку на поверхности				+
C. lusitaniae	короткие цепочки с удлиненными бластокони-диями вдоль закруглений псевдогифы	не образуют пленку на поверхности				+		V		V
C. guilliermondii	довольно короткие, мелкие псевдогифы; кластеры бластоконидий на септе	не образуют пленку на поверхности	+			+		+^W		+^W
C. krusei	псевдогифы с многократно ветвящимися удлиненными бластоконидиями	хороший по-верхностный рост на поверхности бульона			+^V	+

Примечание: + - позитивный; 0- негативный; V – виды или культуры вариабельны; R – редко в виде рудиментарных форм; W- реакция может быть слабо выражена

Дата добавления: 2015-08-21