Субтилигаза в лигировании пептидов

В заключение рассмотрим еще одно неожиданное направление белковой инженерии, четко обозначившееся в самое последнее время. Во всех вышеупомянутых подходах конструирование белков с новыми свойствами основано на использовании молекулярно-генетических методов направленного мутагенеза. К сожалению, все эти методы обладают одним существенным недостатком: с их помощью невозможно осуществить встраивание в исследуемые полипептидные цепи многих неприродных аналогов аминокислот или других химических соединений, что весьма существенно ограничивает возможности структурно-функциональных исследований белков. Такие модификации можно было бы вносить в процессе химического синтеза пептидов, однако в этом случае невозможно получать пептиды большой длины (как правило, >40 остатков аминокислот) из-за накопления побочных продуктов синтеза, что затрудняет последующую очистку основного продукта и снижает выход пептидов.

Недавно был разработан альтернативный подход к химическому синтезу длинных пептидов, заключающийся в ферментативном лигировании предварительно синтезированных химическими методами коротких пептидов друг с другом. Этот подход стал возможен благодаря созданию с помощью направленного мутагенеза аналога субтилизина, так называемого субтилизина BPN’, катализирующего образование пептидных связей в водных растворах. Такой мутантный фермент, получивший название субтилигазы, содержит в своей полипептидной цепи две мутационные замены: Ser заменен на остаток Cys, а Pro – на Ala. Первая замена в активном центре субтилизина резко повышает его способность к аминолизу (т.е. образованию пептидной связи) по сравнению с гидролитической активностью при использовании в качестве субстратов тетрапептидных эфиров. Вторая мутация изменяет конформацию мутантного активного центра, компенсируя стерические эффекты, вызванные введением остатка Cys, что еще более улучшает каталитические свойства фермента.

Д. Джексоном с соавторами (1994 г.) разработана стратегия синтеза крупных полипептидных цепей с использованием субтилигазы, реализованная в синтезе модифицированной рибонуклеазы А, обладающей ферментативной активностью. На первом этапе синтеза был получен полностью незащищенный пептид, представляющий собой C-концевой фрагмент РНКазы А, и он был использован в дальнейшем в качестве акцепторной молекулы (см. схему).

R-NH-пептид_Y-CO-R’ + H₂N-пептид_Z-COOH

¯ 1. Субтилигаза

R-NH-пептид_Y-CO-NH-пептид_Z-COOH

¯ 2. Zn/CH₃COOH

H₂N-пептид_Y-CO-NH-пептид_Z-COOH

R-NH-пептид_X-CO-R’ ¯ 3. Повторение этапов 1 и 2

H₂N-пептид_X-CO-NH-пептид_Y-CO-NH-пептид_Z-COOH

Изоникотиноил	Гликолат-фенилаланиламид (glc-F-NH2);

X, Y, Z – различные пептиды

Следующий N-концевой донорный фрагмент полипептидной цепи этерифицирован по С-концу гликолат-фенилаланиламидом (glc-F-NH₂). Полученный эфир эффективно ацилируется субтилигазой, что отражает особенности ее субстратной специфичности: фермент предпочитает использовать в качестве субстрата эфиры, в которых освобождается группа glc-F-NH₂. В отличие от этого донорный пептид содержит на N-конце дополнительную изоникотиноильную защитную группу, что предотвращает его лигирование самого на себя. Такая группа вводится на последней стадии твердофазного синтеза пептидов и проявляет устойчивость к разбавленной плавиковой кислоте (HF), которая использовалась для снятия защиты с боковых цепей пептидов и отщепления самих пептидов от твердого носителя. После каждого лигирования пептидов изоникотиноильную группу удаляли в условиях мягкого восстановления (в присутствии цинка и уксусной кислоты) для освобождения NH₂-группы – необходимой участницы очередного цикла лигирования.

Исходя из субстратной специфичности субтилигазы (фермент эффективно использует крупные гидрофобные донорные субстраты и малоэффективен с отрицательно заряженными остатками аминокислот или остатками пролина, попадающими в его активный центр), карту полипептидной цепи РНКазы А разделили на шесть фрагментов. Эти фрагменты были синтезированы и лигированы друг с другом в соответствии с вышеприведенной схемой с выходом, достигающим 70% на каждом этапе. В результате была получена полноразмерная полипептидная цепь РНКазы А (124 аминокислотных остатка), которая после спонтанного фолдинга приобрела искомую ферментативную активность. В ходе синтеза отдельных пептидов исследователи заменили два остатка His, находящихся в активном центре фермента (положения 12 и 119), на остатки 4-фторгистидина. Поскольку это производное His обладает pK_a = 3,5 (pK_a His = 6,8), у искусственной РНКазы А наблюдали резкий сдвиг в оптимуме pH реакции гидролиза субстрата без заметных изменений k_кат, что было особенно неожиданным результатом, позволившим сделать интересные выводы о механизме ферментативной реакции, осуществляемой РНКазой А. Позднее субтилигаза была успешно использована для синтеза модифицированного гормона роста человека и циклических пептидов.

Значение результатов, полученных в ходе направленного изменения субстратной специфичности субтилизина, превратившегося в субтилигазу, выходит далеко за рамки чисто прикладного использования нового искусственного фермента. Это и многие другие подобные исследования, осуществленные методами белковой инженерии, однозначно указывают на возможность изменения субстратной специфичности известных ферментов путем замены в них одного или нескольких критических аминокислотных остатков. Такого рода результаты, примеры которых уже были приведены выше и более подробно будут рассмотрены в следующем разделе, приподнимают завесу над механизмами молекулярной эволюции метаболических путей живого организма, лежащих в основе его существования. История развития молекулярной биологии и генетики показывает, что практически любой неизвестный в природе механизм, разработанный и реализованный исследователем в физиологических условиях в пробирке, уже используется in vivo в существующих генетических системах. Однажды на семинаре, когда кто-то пытался выдать банальность за новую информацию, Р.Б. Хесин сказал: "Это новость только для того, кто не читает научной литературы". Мы записаны в библиотеку Природы, однако, несмотря на все усилия, в настоящее время в состоянии читать на разных языках только букварь, написанный под ее диктовку. Вся область белковой инженерии, которая, на первый взгляд, кажется блестящим порождением лишь одного интеллекта человека, не есть исключение, поскольку ферменты с новой субстратной специфичностью могут быть результатом точковых мутаций, непрерывно происходящих в геноме любого живого организма. А следовательно, Природа непрерывно конструирует новые белки и отбирает лучшие варианты с самого момента возникновения жизни на Земле. И этот процесс ежеминутно происходит в биосфере, в том числе и в онтогенезе эукариот.

Дата добавления: 2015-08-18