Химический мутагенез

Делеции и вставки, создаваемые в структурных частях генов, как правило, их инактивируют, особенно в тех случаях, когда такие мутации приводят к сдвигу открытых рамок считывания. Поэтому делеции и вставки in vitro используют главным образом для поиска и изучения регуляторных элементов генов, влияющих на эффективность их экспрессии. Большое значение для исследования функционирования белков имеют методы мутагенеза in vitro, направленные на получение точковых мутаций, следствием которых являются одиночные замены аминокислот в полипептидных цепях.

Распространенным методом введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitro является химический мутагенез одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК. Принцип подобных методов заключается в том, что некоторые химические мутагены, такие как бисульфит натрия, гидроксиламин или метоксиламин, действуют только на одноцепочечные участки ДНК. Следовательно, получив молекулы ДНК, содержащие одноцепочечные бреши в исследуемых участках генов, можно с помощью бисульфита натрия дезаминировать остатки цитозина в этих участках, т.е. превратить их в остатки урацила. После достройки цепи такой мутагенизированной молекулы ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli происходит замена исходных G‑С-пар на T–U. Затем мутагенизированные молекулы ДНК с помощью трансформации вводят в бактериальные клетки, где по завершении первого раунда репликации в молекуле осуществляется замена остатков U на T и полная замена G–С-пары на A–T, т.е. имеет место обычная транзиция.

Одноцепочечные мутагенизированные участки ДНК удобно получать путем гибридизации одноцепочечной ДНК вектора с двухцепочечной ДНК того же вектора, содержащего клонированный ген или его участок, который необходимо мутагенизировать. В этом случае в образующемся гибриде-гетеродуплексе, одна цепь которого принадлежит вектору без вставки, а другая – вектору со вставкой, происходит выпетливание последовательности вставки в виде одноцепочечного участка ДНК. Обсуждаемый подход к получению статистического набора точковых мутаций с использованием химических мутагенов позволяет легко создавать большое число мутантных молекул ДНК, содержащих одну или несколько мутаций в разных сочетаниях. Последующий отбор мутантов на основе новых биохимических или иных параметров мутантных белков (исчезновение, ослабление или усиление ферментативной активности, появление новой активности или новых иммунологических свойств и т.п.) позволяет идентифицировать остатки аминокислот в исследуемых белках, отвечающие за эти изменения.

Несмотря на удобство введения такого рода мутаций в ДНК in vitro, химический мутагенез накладывает ограничения на спектр возникающих мутаций, так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают обязательные изменения. Поэтому многие мутации никогда не могут быть получены с помощью химических мутагенов. Проблему можно частично решить, используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов, например N-гидроксицитозинтрифосфат, который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G, или создавая такие условия, при которых репарирующая ДНК-полимераза начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды. Все перечисленные выше методы локального мутагенеза, осуществляемого in vitro, позволяют, в конечном счете, получать набор случайных мутаций, локализованных на определенном исследуемом участке ДНК. Мутагенизированные молекулы ДНК из одной реакционной пробирки представляют собой сложную смесь, в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций. Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить трудоемкую процедуру отбора, сопряженную с анализом большого числа мутантов. Подлинную революцию в направленном мутагенезе произвела разработка методов с использованием синтетических олигонуклеотидов.

Дата добавления: 2015-08-18