Хід роботи

Відбір ґрунтових зразків

За хімічним складом і структурою ґрунт неоднорідний, тому для мікробіологічного аналізу використовують середню пробу, відбираючи і змішуючи зразки з різних місць ділянки. Проби відбирають на дослідній ділянці площею 100–200 м² у шаховому порядку чи по діагоналі із розрахунку 7–10 проб по 0,5 кг кожна. Інструменти (ніж, совок, лопата) перед взяттям кожної проби добре вичищають, протирають спитром і обпалюють на вогні. Відбір зразків ґрунту здійснюють у такій послідовності: стерильним ножем знімають і відкидають верхній шар землі (2см), після чого стерильним совком відбирають ґрунт, кладуть у стерильний пергаментний пакет, який знаходиться в мішку з тканини. Останній поміщають у поліетиленовий пакет, куди кладуть етикетку з відмітками: дата відбору проби; місце взяття проби; опис рельєфу і рослинності; характер ґрунту і ґрунтового профілю; глибина взяття проби.

Якщо проби відбирають на різній глибині, то викопують яму, поверхню стінки ями зрізають стерильним ножем і стерильним совком беруть пробу з певного горизонту. Аналіз ґрунту проводять не пізніше 24 годин після взяття проби.

Визначення гігроскопічної води

У завчасно висушеному до постійної ваги скляному бюксі зважують 1–2 г повітроосушного ґрунту. Бюкси з ґрунтом ставлять в сушильну шафу відкритими. Ґрунт висушують за температури 100–105°С 3–4 год. У процесі сушіння не можна відкривати шафу і ставити до неї нові проби ґрунту. Після закінчення сушіння бюкси закривають і ставлять в ексикатор для охолодження. На дно ексикатора насипають пропалений хлористий кальцій. Після охолодження протягом 20–30 хв бюкси зважують і за різницею ваги визначають уміст гігроскопічної води в ґрунті за формулою

% гігроскопічної води =а ·100/в

де а – різниця у вазі до і після сушіння ґрунту (г); в – вага сухого, тобто висушеного за температури 100–105°С ґрунту (г).

Приклад. Вага зваженого повітроосушного ґрунту – 1,5167 г. Вага ґрунту після висушування, тобто сухого ґрунту – 1,4890 г. Втрата у вазі – 0,0277 г. Уміст гігроскопічної води дорівнює 0,0277 ·100/1,4890=1,86%.

Визначення рН ґрунту

Для визначення рН ґрунту готують ґрунтову витяжку: 10 г ґрунту заливають 25 мл дистильованої води, позбавленої СО₂. Для виділення з води СО₂ останню кип'ятять протягом години. Ґрунт з водою збовтують 5 хв (колбу закривають корком) і в отриманій суспензії потенціометрично визначають рН.

Підготовка зразків ґрунту до мікробіологічного аналізу

Підготовку ґрунтових зразків до мікробіологічного аналізу здійснюють таким чином. Ретельно перемішаний ґрунт висипають на протерте спиртом та обпалене полум’ям годинникове скло. Із нього стерильним пінцетом видаляють корінці та інші домішки. З різних місць розподіленого на склі зразка ґрунту стерильним шпателем відбирають невеликі порції у стерильну зважену порцелянову ступку. Зважують 1 г ґрунту усередненого зразка.

Щоб зруйнувати ґрунтові агрегати і десорбувати клітини мікроорганізмів з ґрунтових часток зразок треба спеціально обробити. Для цього беруть дві стерильні колби ємністю 250 мл: у першу наливають 100 мл стерильної водопроводної води, другу залишають порожньою. З першої колби відбирають 0,4–0,8 мл води, зволожують ґрунт у порцеляновій ступці до утворення пасти, суміш розтирають 5 хв стерильним гумовим товкачиком. Розтерту ґрунтову масу переносять у порожню колбу, розводять стерильною водою, взятою з першої колби, використовуючи для цього весь об’єм води. Усі маніпуляції проводять біля полум’я пальника. Уміст колби струшують на шутелі 5 хв, відстоюють 30 с, щоб осіли частки ґрунту, і відразу готують ґрунтову суспензію.

Приготування серії розведень ґрунтових витяжок

Розведення роблять у стерильному 0,5%-му розчині хлориду натрію. Для цього його розливають стерильною піпеткою по 9 мл у стерильні сухі пробірки. Приготування серії розведень виконують в такій послідовності: із колби з ґрунтовою витяжкою відбирають 1 мл суміші і переносять до пробірки зі стерильним розчином хлориду натрію. Якщо вихідний матеріал (ґрунтова витяжка) розведений у 100 разів (1:10²), то отримують розведення 1:10³. Суспензію цього розведення перемішують за допомогою нової стерильної піпетки. Потім тією ж піпеткою відбирають 1 мл одержаного розведення і переносять до другої пробірки, отримують розведення 1:10⁴. Цю операцію повторюють 5–7 разів, використовуючи у кожному випадку чисту піпетку. Ступінь розведення визначають передбачуваною кількістю мікроорганізмів у дослідному зразку ґрунту. З розведень роблять висів на м’ясопептонний агар (МПА). Для цього у стерильні чашки Петрі розливають розплавлений МПА по 20–30 мл. Стерильною піпеткою наносять краплю (0,05мл) відповідного розведення на поверхню МПА. Краплю розподіляють рівномірно по поверхні середовища стерильним шпателем. Із кожного розведення роблять 3 паралельні висіви. Чашки з посівами інкубують у термостаті за 28⁰С. Колонії, що виросли на МПА, підраховують через дві доби після висіву. Найкращим розведенням вважають таке, у разі висіву з якого на МПА на одній чашці виростають 50–100 колоній.

Визначення кількості мікроорганізмів в 1г ґрунту

Кількість мікроорганізмів в 1г ґрунту визначають за формулою

( ± 2 )∙К∙1/v,

де = /n – середня кількість колоній, що виросли на МПА з даного розведення;

=± /n – середнє квадратичне відхилення; 2 – t-критерій за рівня достовірності 95%; К – розведення, з якого проведено висів; v – об’єм суспензії, взятої для висіву, мл; – загальна кількість підрахованих колоній під час висіву з даного розведення; n – число повторів.

Для визначення кількості дріжджів роблять висіви із розведень ґрунтових суспензій на сусло-агар (10⁰Б), а для визначення кількості пліснявих грибів – на середовище Чапека–Докса. Виділені колонії описують, мікроскопують та пересівають на скошений МПА у пробірках.

Контрольні запитання

· Поняття гігроскопічної води. Її визначення у ґрунтових зразках.

· Кислотність середовищ мешкання бактерій. Нейтрофільні та алкалофільні бактерії.

· Ацидофільні мікроорганізми. Механізми адаптації до середовищ із низьким значенням рН.

· Принцип визначення рН ґрунту.

· Визначення загальної кількості ґрунтових мікроорганізмів.

Дата добавления: 2015-08-18