Лекция 7. Разобравшись с элементарными взаимодействиями, — рассмотрим сегодня вторичную

Разобравшись с элементарными взаимодействиями, — рассмотрим сегодня вторичную структуру белков. Прежде всего у нас речь пойдет о регулярных вторичных структурах — об a-спиралях и о b-структуре, — но не только о них.

Укладка a и b-структур в глобулу определяет третичную структуру белка (Рис.7-1). Эти вторичные структуры отличаются определенными, периодическими конформациями главной цепи — при разнообразии конформаций боковых групп.

Рис.7-1. Вторичная структура полипептидной цепи (a-спираль и тяж b-листа) и третичная структура белковой глобулы.

Начнем со спиралей. Они могут быть левые и правые (Рис.7-2), у них может быть разный период и шаг. Правые (R) спирали приходят к нам, завиваясь против часовой стрелки (что отвечает положительному отсчету угла в тригонометрии); левые (L) — приходят, вращаясь по стрелке.

Рис.7-2. Правые (R) и левые (L) спирали. Под ними показан отсчет положительного угла в тригонометрии: при этом "близкая к нам" стрелка вращается против хода часов.

Важнейшие спирали в полипептидной цепи держатся водородными связями, где С=О группы остова полипептида связаны с лежащими от них в направлении С-конца цепи H-N группами. В принципе, возможны следующие спирали, стянутые Н-связями (Рис.7-3): 2₇, 3₁₀, 4₁₃ (обычно именуемая a) и 5₁₆ (она же p). Здесь в названии "2₇" — "2" означает связь со 2-м по цепи остатком (см. Рис.7-3), а "7" — число атомов в цикле (O^......H-N-C'-C^a-N-C'), замыкаемом этой связью. Тот же смысл имеют цифры и в названии других спиралей.

Рис.7-3. Водородные связи (они показаны стрелками), характерные для разных спиралей.

Какие из этих спиральных структур преобладают в белках? a-спирали. Почему? Ответ на этот вопрос дает карта Рамачандрана для типичного аминокислотного остатка — аланина (Рис.7- 4), на которой отмечены конформации, периодическое повторение которых приводит к завязыванию изображенных на Рис.7-3 водородных связей.

Рис.7-4. Конформации различных вторичных структур на фоне карты разрешенных и запрещенных конформаций аминокислотных остатков. 2₇^R, 2₇^L: правая и левая спираль 2₇; 3₁₀^R, 3₁₀^L: правая и левая спираль 3₁₀; a_R, a_L — правая и левая a-спираль; p_R, p_L — правая и левая p-спираль. b — b-структура (подробности см. на Рис.7-8б). Р — спираль Poly(Pro)II. — конформации, разрешенные для аланина (Ala); — области, разрешенные лишь для глицина, но не для аланина и других остатков; — области, запрещенные для всех остатков. j и y — углы внутреннего вращения в белковой цепи.

Видно, что только спираль a_R (a-правая) лежит достаточно глубоко внутри области, разрешенной для аланина (и для всех других остатков). Другие спирали лежат либо на краю этой области (например, левая спираль a_L или правая спираль 3₁₀), где конформационные напряжения уже возрастают, либо в области, доступной только глицину.
Поэтому можно ожидать, что именно правая a-спираль должна быть, как правило, более стабильной, и потому преобладать в белках — что и наблюдается. В правой a-спирали (Рис.7-5) все атомы упакованы оптимально: плотно, но без напряжений; поэтому не удивительно, что в белках таких спиралей много, а в фибриллярных белках они достигают гигантской длины и включают сотни аминокислотных остатков.

Рис.7-5. Правая a-спираль. (а) Атомарная структура. R — боковые группы. Голубые линии — водородные связи. (б) Схематическое изображение одного витка той же a-спирали, вид с торца. Стрелка показывает поворот спирали (в расчете на один остаток) по мере ее приближения к нам. Картинка (а) взята из [3] и адаптирована.

Левых a-спиралей в белках практически нет. Нет и спиралей 2₇, которые, мало того что лежат на самом краю разрешенной области, но еще имеют энергетически невыгодный, почти прямой угол схождения N-H и О=С групп.
Практически нет в белках и спиралей p. Они тоже лежат на самом краю разрешенной области, да еще и витки в них слишком широки, так что p-спирали имеют энергетически невыгодную пустую "дырку" на оси. А вот спирали 3₁₀ (в основном — правые, — левые пригодны практически лишь для глицинов) в белках есть — правда, в виде коротких (из трех-четырех остатков) и деформированных фрагментов (из-за стерических напряжений: слишком тугая спираль! — соответствующая ей конформация лежит на самом краю разрешенной области).

Отметим одно свойство спиралей, хорошо видное на Рис.7-5а: на их N-конце сидят свободные от внутриспиральных водородных связей Н атомы N-H групп, а на С-конце — свободные от водородных связей О атомы С=О групп. Так как электронное облако с Н атома частично стянуто электроотрицательным N атомом, а электроотрицательный О атом сам стягивает электрон с С' атома, — N-конец спирали несет положительный, а С-конец — отрицательный парциальный заряд. То есть спираль представляет собой длинный диполь: величина суммарного (поставляемого тремя NH-группами) парциального "+" заряда на ее N-конце составляет около половины протонного, а "-" заряда на С-конце a-спирали — около половины электронного заряда.

Теперь рассмотрим регулярные структуры без водородных связей внутри каждой, но соединенные водородными связями между собой.

Рис.7-6. Схема хода цепи и расположения водородных связей в параллельной b , антипараллельной b и смешанной b b-структуре. Видно, что Н-связи одного остатка в b-тяже направлены одну сторону, следующего — в противоположную, и т.д.

Почти вытянутые (все углы в главной цепи — почти trans), слегка скрученные цепи образуют b-структуру. Она бывает (Рис.7-6) параллельной (b ), антипараллельной (b ) и смешанной (состоящей из b и b ).
b-структура стянута водородными связями (символы /, \ и | на схемах 7-6). Она существует в виде более или менее крупных листов. Так как поверхность b структуры — рифленая, ее еще называют "складчатой b-структурой" (Рис.7-7).

Рис.7-7. Лист b структуры имеет складчатую поверхность. Боковые группы (см. маленькие отростки) расположены на складках; каждая обращена в ту же, что и складка, сторону, т.е. направленные вниз и вверх боковые группы чередуются вдоль b-тяжа. Картинка взята из [3] и адаптирована.

b-структурные листы всегда несколько скручены (Рис.7-8а) из-за того, что несколько скручены (Рис.7-8б) отдельные b-тяжи — и потому по ходу тяжа несколько меняется направленность водородных связей. А тяжи, в свою очередь, скручены из-за того, что наиболее энергетически выгодная конформация остатков с боковыми группами сдвинута к центру стерически разрешенной области (Рис.7-8в). Скрученность отдельного b-тяжа — левая (у L аминокислот! — у D было бы наоборот): вы видите (Рис.7-8б), что боковые группы тяжа поворачиваются по часовой стрелке (на»-165^o на каждый остаток) по мере приближения тяжа к нам.
В результате, поворачиваются и Н-связи (на»-165^o на каждый остаток, т.е. на -330^o=+30^o на пару остатков - повторяющуюся единицу b-структуры), так что угол между соседними тяжами b-структуры (если смотреть с кромки листа, Рис.7-8а) обычно составляет около -25^о ("минус", как всегда, означает, что ближний к нам b-тяж повернут по часовой стрелки относительно более далекого). Таким образом, b-лист имеет левое скручивание, если смотреть с края этого листа (и правое, если смотреть вдоль b-тяжей на поворот линии Н-связей).

Рис.7-8. (а) Скрученность b-листа. b-тяжи изображены стрелками, водородные связи между ними — голубыми линиями. (б) Схематическое изображение одного витка b-тяжа, вид с торца. Кружки — боковые группы; их номера возрастают по мере удаления от читателя. Голубые линии укаывают направление С=О групп, завязывающих Н-связи в листе, большей стрелкой — поворот b-тяжа при приближении к нам на один остаток, меньшей стрелкой — поворот направленных в одну сторону водородных связей при приближении к нам на два остатка. (в) Конформация идеальной (не скрученной) параллельной ( ) и антипараллельной ( ) b-структуры для поли(Gly), и усредненная конформация реальной (сложенной из L аминокислот) скрученной (twist) b-структуры. Пунктир показывает область энергетического минимума для отдельно взятого остатка Ala; контуром показаны границы области разрешенных конформаций этого остатка. Диагональ jy-карты соответствует плоской периодичной структуре, имеющей 2 остатка на виток. Над диагональю лежат левые (L) спирали, под ней — правые (R). Картинки (а), (в) взяты из [3] и адаптированы.

Есть спирали и без водородных связей, где плотная (а значит — энергетически выгодная) упаковка держится чисто на Вандерваальсовых контактах. Это — полипролиновая спираль. При этом три скрученные в довольно растянутую левую спираль цепи образуют правую супер суперспираль — они плотно закручиваются друг вокруг друга. Из двух возможных типов полипролиновой спирали для нас важна спираль poly(Pro)II: она реализуется в коллагене. В этой спирали пептидные группы пролинов находятся в обычной (trans) конформации. Отложим более подробное рассмотрение коллагеновой спирали до соответствующего места курса, а пока ограничимся общим ее видом (Рис.7-9) и отметим на Рис.7-4 область соответствующей ей конформации цепи: видно, что она довольно близка к b структуре.

Рис.7-9. Общий вид тройной правой суперспирали из левых спиралей Poly(Pro)II.

Параметры наиболее важных регулярных вторичных структур белковых цепей суммируются в следующей таблице:

Таблица 7/1. Основные геометрические параметры наиболее распространенных в белках вторичных структур.

Структура	H-связь	Остаток/виток	Смещение/остаток ()	f	y
Спираль aR	CO0—HN+4	+3.6	1.5	-60^0	-45^0
Спираль (310)R	CO0—HN+3	+3	2.0	-50^0	-25^0
Лист b	меж цепей^*	-2.3	3.4	-135^0	+150^0
Лист b	меж цепей^*	-2.3	3.2	-120^0	+135^0
Спираль Poly(Pro) II	нет	-3	3.0	-80^0	+155^0

^* Расстояние между тяжами в b-листе: 4.8

Примечание. Данные взяты из [3, 6]. Все цифры округлены. "+" означает правую спираль, "-" — левую.

Кроме регулярных, в полипептидных цепях есть еще и нерегулярные вторичные структуры, — т.е. стандартные структуры, не образующие длинных периодических систем.
Это — так называемые b-изгибы ("b" — потому, что они часто стягивают верхушки соседних b-тяжей в антипараллельных b шпильках). Характерный вид наиболее важных b-изгибов и конформации входящих в них остатков представлены на Рис.7-10. Сравните Рис.7-10в с Рис.7-4 и Таблицей 7/1, и обратите внимание на то, что изгибы I (и особенно III) близки по конформации к витку спирали 3₁₀.

Рис.7-10. b-изгибы. (а) b-изгиб типа I (b-изгиб типа III очень на него похож и потому не нарисован отдельно). (б) b-изгиб типа II. Его основное отличие от b-изгиба I — переворот пептидной группы, соединяющей остатки i+1 и i+2. (в) Конформации фиксируемых водородной связью остатков i+1 и i+2 в b-изгибах. В b-изгибе III оба остатка i+1 и i+2 имеют одинаковую конформацию (отмечена жирной точкой). Конформации остатков i и i+3 в b-изгибах не фиксированы; они фиксируются b-структурой - если она прирастает из изгиба, как на рисунке (г), где дана схема b-шпильки с b-изгибом в ее вершине. Картинки (а), (б), (в) взяты из [3] и адаптированы.

В заключение — несколько слов о том, как экспериментально обнаруживается вторичная структура.

Конечно, если сделан рентген (или точный многомерный ЯМР) белка — вторичная структура берется из атомных координат.

Впрочем, ЯМР (ядерный магнитный резонанс), который хорошо фиксирует сближенность (до 4 — 5 и менее ) ядер Н-атомов, позволяет определять вторичную структуру даже тогда, когда полную атомную структуру белка построить еще не удается.
Метод ЯМР основан на возбуждении радиоволнами ориентированных в сильном магнитном поле ядер, — тех ядер, которые имеют нечетное число нуклонов (протонов и нейтронов): только они имеют спин и, вследствие этого, — магнитный момент. В белке это — природные "легкие" водороды (¹H), а также вводимые изотопы (¹³С, ¹⁵N и т.д.). Магнитный резонанс наступает на радиочастоте, характерной для данного атома, причем эта частота слегка модифицируется его соседями по химическим связям и по пространству (что и позволяет судить, атом какого остатка возбудился). Возбужденное ядро может передать свое возбуждение соседнему с ним в пространстве ядру с магнитным моментом, и оно отрапортует о полученном возбуждении уже на своей частоте (что и позволит судить о сближенности этих двух магнитных ядер).
Для a-спиралей особенно характерна сближенность H-атома группы C^aH с H-атомом NH-группы 4-го от нее (к С-концу цепи) остатка, а для b-структуры — сближенность Н-атомов NH- и C^aH-групп у остатков, непосредственно соседствующих по цепи, и у остатков, связанных Н-связями в b-листе (Рис.7-11).

Рис.7-11. Сближенность («) ядер водородных атомов, наиболее характерная для a-спирали (а), параллельной (б) и антипараллельной (в) b-структуры. Индексы при атомах главной цепи в рисунке (а) показывают взаимное расположение остатков в цепи.

Однако наиболее важную, пожалуй, роль в определении вторичной структуры играет метод кругового дихроизма (КД). Он не требует знания общей пространственной структуры белка. Наоборот, структурное исследование белка обычно начинается с получения спектров КД. Метод КД основан на различии в поглощении право- и левополяризованного света в спиралях различной закрученности. Из-за этого различия в поглощении плоскополяризованный свет превращается в эллиптически поляризованный.

Характерные спектры эллиптичности в области "дальнего" ультрафиолета (190-240 нм) приведены на Рис.7-12. Показанные спектры зависят от асимметрии окружения пептидных групп и потому рапортуют о том, есть ли в белке вторичная структуре, какая, и сколько ее.

Рис.7-12. Характерные формы спектров КД для полилизина в форме a-спирали (a), b-структуры (b) и неупорядоченного клубка (r). Картинка взята из [6] и адаптирована.

Пептидные группы оптически возбуждаются в "дальнем УФ", при длине волны порядка 200 нм. Это — примерно вдвое большая длина волны, чем та, на которой возбуждаются отдельные атомы. Причина того, что пептидная группа возбуждается более длинноволновым (т.е. менее "жестким") светом, — в делокализации электронов пептидной группы по нескольким атомам, о чем мы уже говорили.

Еще больше делокализованы электроны в ароматических группах — там они "размазаны" не по трем, как в пептидной группе, а по шести атомам. Спектры КД ароматических групп приходятся на длину волны ~250-280 нм (хотя "хвост" этих спектров доходит до ~220 нм). В этом диапазоне длин волн, ~250-280 нм, (в "ближнем" ультрафиолете) изучают асимметрию окружения ароматических боковых групп, — т.е. эффекты, связанные с образованием уже не вторичной, а третичной структуры белка.
В скобках отмечу, что при еще большей делокализации электрона (в более крупных молекулах с кратными связями) — он начинает возбуждаться уже не ультрафиолетовым, а видимым светом (400- 600 нм): свечение таких молекул видно на глаз, т.е. они являются красителями.

Кроме ультрафиолетовых спектров, для регистрации вторичной структуры полипептидов и белков используются инфракрасные спектры. Они отражают различия в колебаниях пептидных групп, вовлеченных и не вовлеченных в разные вторичные структуры (Рис.7-13). Эти измерения более сложны, чем измерения УФ-спектров, так как обычная вода (H₂O) поглощает в той же области; поэтому такие измерения обычно проводятся в тяжелой воде (D₂O). Кроме того, они требуют больше белка, чем измерения УФ-спектров, и более высоких концентраций белка в растворе.

Рис.7-13. Характерные формы инфракрасных спектров пропускания, измеренных в тяжелой воде (D₂O) для полилизина в форме a-спирали (a), b-структуры (b) и неупорядоченного клубка (r). Измерения, в данном случае, проводились в области "амид I", отражающей колебания С=О связи. Картинка взята из [6] и адаптирована.

Дата добавления: 2015-07-16