Ферментные реагенты

Ферменты как аналитические реагенты широко применяются в практике лабораторных исследований при определении содержания в биологических жидкостях различных веществ.

Для определения в исследуемом материале содержания вещества, в биологический материал вводят фермент, катализирующий превращение только этого вещества, создают оптимальные условия реакции (рН, температура) и регистрируют скорость реакции (по образованию продукта или по изменению кофермента). Затем определяют концентрацию искомого вещества по скорости реакции, используя калибровочный график. Применение ферментативных реагентов значительно увеличивает специфичность методов. В настоящее время ферментные реагенты применяются для определения содержания глюкозы, этанола, молочной кислоты и др.

Таблица 10

Ферменты, используемые в диагностических наборах для определения ряда метаболитов

Исследуемый аналит	Фермент	Источник
Мочевина	Уреаза	Бобы канавалии мечевидной
b-D-глюкоза	Глюкозооксидаза, Гексокиназа	Aspergillus niger, Дрожжи
Мочевая кислота	Уриказа	Печень свиньи
Эфир холестерина	Холестеринэстераза	Поджелудочная железа крупного рогатого скота
Триглицериды	Липопротеинлипаза	Pseudomonas sp.

Для определения содержания глюкозы используются – глюкозооксидаза и пероксидаза. Ферментативное с колориметрическим завершением определение содержания глюкозы заключается в том, что она в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется до глюконолактона.

Восстановленный кофермент ФАДН₂ окисляется молекулярным кислородом с образованием эквимолярного количества перекиси водорода.

ФАДН₂ + О₂ ® ФАД⁺ + Н₂О₂

Под действием пероксидазы Н₂О₂ окисляет хромоген – о-толидин, который при этом меняет бесцветную окраску на голубую (интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию глюкозы).

В качестве хромогенов могут быть использованы и другие реагенты (4(п -бензохинонмоноимино)-феназон, образующийся при взаимодействии фенола и 4-аминоантипирина, 4-аминофеназон, дианизид, йодистый калий и др.)

Ферментативный метод определения мочевины состоит из двух этапов. Первый этап - общий для всех уреазных методов, заключается в том, что под действием уреазы происходит гидролиз мочевины до аммиака.

уреаза

H₂NC(O) NH₂ ® 2 NH3 + Н₂О + СО₂

На втором этапе определяется концентрация аммиака, образовавшегося на первом этапе. Для регистрация концентрации аммиака используют способы: взаимодействие с хромогеном (салицилат или фенол с гипохлоритом натрия), использование сочетанных ферментативных реакций (глутаматдегидрогеназа, глутаминсинтетаза, лейциндегидрогеназа), ион-селективных электродов с иммобилизированным ферментом (уреазой), рН-индикаторов (технология «сухой химии»).

Процедуры, связанные с использованием ферментных реагентов можно автоматизировать, что значительно повышает чувствительность и точность определения веществ. Для анализа различных веществ применяют два вида устройств с иммобилизованными ферментами – ферментные электроды и автоматические анализаторы.

Дата добавления: 2015-07-14