В МЕДИЦИНЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

В МЕДИЦИНЕ

Для студентов лечебного и педиатрического факультетов НГМУ

Новосибирск 2011

УДК 615.355:615.166(072)

ББК 28.072+35.66я73

П-75

Вохминцева Л.В.

Применение ферментов в медицине. - Новосибирск, 2011.- 40с.

В настоящем учебном пособии представлены основы медицинской энзимологии. Рассмотрены принципы энзимодиагностики, причины изменения активности ферментов в сыворотке крови, пути повышения специфичности энзимологических исследований. В пособие включены правила определения активности ферментов в биологических средах. Изложены основные направления использования ферментов, а именно, применение ферментов в качестве лекарственных препаратов (заместительная терапия, удаление некротирующих тканей, фибринолитические средства и др.) и аналитических реагентов.

Учебное пособие может быть использовано при подготовке студентов к практическим и лабораторным занятиям по курсу биологической химии, а также коллоквиумам и экзамену. Пособие предназначено для студентов 2 курса лечебного, педиатрического факультетов.

Рецензенты:

О.Н. Потеряева, д.м.н., профессор кафедры общей и биоорганической химии

Е.Н. Самсонова, д.м.н., профессор кафедры патофизиологии с курсом клинической патофизиологии.

Утверждено и рекомендовано к печати ЦМК фармакологического факультета НГМУ (протокол №_ от _________ 2011 г.)

ПРЕДИСЛОВИЕ

Настоящее учебное пособие разработано в соответствии с Федеральными государственными образовательными стандартами высшего профессионального образования по направлению подготовки (специальностей) «Лечебное дело» (060101) и «Педиатрия» (060103), утвержденными 8 ноября 2010 г. а также рабочими программами по биологической химии, на основании которых ведётся подготовка специалистов в ГОУ ВПО Новосибирском государственном медицинском университете по специальностям «Лечебное дело» и «Педиатрия».

Учебной пособие предназначено для самостоятельной подготовки к практическим занятиям по биохимии для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов по теме «Ферменты».

Пособие состоит из нескольких частей. Первая часть включает вопросы использования определения активности ферментов в биологических жидкостях с целью диагностики заболеваний. Освящены основные причины изменения активности ферментов в сыворотке крови, представлены недостатки энзимологических исследований и пути их преодоления.

Во второй части пособия представлены основные направления использования ферментов в качестве лекарственных средств. Уделено внимание преимуществам и недостаткам иммобилизованных ферментов. В раздел включены основные причины ограничения применения ферментных препаратов.

Применение ферментов в качестве аналитических реагентов отражено в третьей части пособия. Рассмотрены примеры использования ферментов в технологии «сухой химии», иммобилизованные ферменты как рабочие части ферментных электродов и автоматических анализаторов, иммуноферментный анализ.

Для контроля самоподготовки студентов в приложении 1. представлены задания в тестовой форме.

Для углубления представлений об использования ферментов в биохимических методах исследования и в качестве аналитических реагентов, ферментных препаратов можно использовать интернет-ресурсы и литературу, представленные в конце пособия.

ВВЕДЕНИЕ

Биологическая химия (от греч. bios – жизнь) – наука о химическом строении и функциях веществ, входящих в состав живой материи и их превращениях в процессах жизнедеятельности. Совокупность этих превращений в постоянной взаимосвязи с окружающей средой обеспечивает функционирование живых организмов в условиях сбалансированности процессов синтеза и распада веществ в клетках и тканях.

Инструментами химических превращений в клетке являются ферменты, которые представляют собой биологические катализаторы белковой природы. Всё многообразие биохимических реакций, протекающих в организме человека, катализируется соответствующими ферментами. В отличие от неорганических катализаторов ферменты имеют свои особенности. Во-первых, скорость ферментативного катализа на несколько порядков выше, чем скорость небиологического катализа. Во-вторых, действие каждого фермента высокоспецифично, т.е. каждый фермент действует только на свой субстрат или группу родственных субстратов, тогда как неорганические катализаторы ускоряют различные реакции. В-третьих, ферменты катализируют химические реакции в мягких условиях, т.е. при обычном давлении, невысокой температуре (20-50 °С) и при значениях рН среды, в большинстве случаев, близких к нейтральному.

Учение о ферментах – энзимология является важнейшей и стремительно развивающейся областью биохимии. Большие достижения в области химии и биохимии ферментов, развитии методов их выделения и очистки, разработка простых способов определения их активности позволили использовать ферменты в медицине, биотехнологии. Ферменты являются важным инструментом в изучении механизмов обмена веществ, в расшифровке структуры химических соединений.

В настоящее время можно выделить основные направления медицинской энзимологии – энзимодиагностику, энзимотерапию, использование ферментов в качестве аналитических реагентов, которым посвящены о сновные разделы учебного пособия.

1. ЭНЗИМОДИАГНОСТИКА

Одним из направлений медицинской энзимологии является энзимодиагностика – исследование ферментов в биологических средах организма с диагностической целью. Измерение активности ферментов играет важ­ную роль в диагностике и лечении целого ряда заболеваний. Активность ферментов измеряют не только при наследственных дефектах ферментов, но и при большинстве заболеваний. Изменение концентрации (активнос­ти) фермента является скорее следствием, чем причиной патологического процесса.

Для трактовки результатов необходимо знать:

- относится ли данный фермент к функциональным (секреторным) или нефункциональным (экскреторным или внутриклеточным) ферментам;

- внутриклеточную локализацию фермента (мембранный, цитоплазматический, митохондриальный);

- скорость синтеза фермента, скорость высвобождения из клеток и удаления из внеклеточной жидкости путём инактивации, разрушения и экскреции;

- наличие в биологическом материале активаторов и ингибиторов этого фермента;

- наличие фармакологической и ятрогенной интерференции.

Для энзимодиагностики, определения активности ферментов используют наиболее часто плазму [1]или сыворотку[2] крови. Кроме крови, для энзимодиагностики можно также использовать и мочу. Гораздо реже, в основном в специализированных клиниках, используют также лимфу, спинно-мозговую жидкость, синовиальную жид­кость, бронхолаважную жидкость, экссудаты из плевральной и брюшной полости. Кроме того, определить активность ферментов можно в тканях: биоптатах, форменных элементах крови. Наиболее часто в медицинской практике используют сыворотку или плазму крови.

1.1. Функциональные и нефункциональные ферменты и причины изменения их активности

Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы (табл.1). Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плазму крови определёнными органами. В крови человека эти ферменты, проферменты и их субстраты в норме циркулируют и выполняют физиологические функции. Эта группа ферментов называется функциональными ферментами (или секреторными ферментами). Основным источником функциональных ферментов является печень. К ним относятся, например, липопротеинлипаза, сывороточная холинэстераза, проферменты систем свёртывания, фибринолиза и комплемента (табл. 1). Ренин крови синтезируется в почках. Концентрация функциональных ферментов в крови такая же, как в тканях (печени), или более высокая.

Изменение активности функциональных (секреторных) ферментов при патологии обычно заключается в понижении их активности в сыворотке или плазме крови. Причинами уменьшения активности (как правило, вследствие снижения количества ферментов) являются уменьшение числа клеток, секретирующих фермент (снижение активности сывороточной холинэстеразы при циррозе печени или снижение пепсиногена при гастроэктомии), избирательная недостаточность синтеза ферментов вследствие наследственных дефектов (уменьшение церулоплазмина при болезни Вильсона-Коновалова), наличие ингибиторов в крови, нарушение функциональной активности органа при патологии (в первую очередь нарушается белоксинтезирующая функция печени при гепатитах), а также недостаточность аминокислот, витаминов или микроэлементов, необходимых для синтеза ферментов.

Таблица 1

Ферменты крови

Функциональные ферменты	Нефункциональные ферменты
Секреторные: Сывороточная холинэстераза Липопротеинлипаза Лецитинхолестеринацилтрансфераза Плазмин Ренин	Внутриклеточные: Аланинаминотрансфераза Аспартатаминотрансфераза Лактатдегидрогеназа Креатинкиназа Щелочная фосфатаза g-глутамилтрансфераза Глутаматдегидрогеназа Альдолаза Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Глутатионредуктаза Экскреторные: a-Амилаза Липаза Трипсин Пепсин

Однако большинство ферментов сыворотки крови являются нефункциональными ферментами (табл.1), т.е. не выполняют известных физиологических функций, их субстраты в сыворотке не обнаруживаются. Эти ферменты работают в клетках тканей и органов (внутриклеточные ферменты) и не имеют физиологического значения в плазме крови. К внутриклеточным ферментам относят аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу, креатинкиназу, лактатдегидрогеназу, щелочную фосфатазу, g-глутамилтрансферазу и др.

Кроме того, к нефункциональным относят также ферменты, секретируемые экзокринными железами (экскреторные ферменты). Примерами экскреторных ферментов являются пепсин, трипсин, a-амилаза, липаза. Небольшие количества внутриклеточных и экскреторных фер­ментов присутствуют в крови как результат нормального клеточного обновления. У здорового человека низкая активность нефункциональных ферментов (внутриклеточных и экскреторных) в плазме поддерживается на определённом уровне, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток при апоптозе и скоростей разрушения и выведения из кровотока.

Основной причиной повышения активности нефункциональных ферментов в крови является повреждение структуры клеток. При нарушении проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе) освобождается большое количество ферментов, и их концентрация в крови растёт.

Таблица 2

Внутриклеточная локализация ферментов

Ферменты	Компартмент
g-Глутамилтрансфераза Щелочная фосфатаза	Плазматическая мембрана
Лактатдегидрогеназа Аспартатаминотрансфераза Аланинаминотрансфераза Альдолаза Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа Глутатионредуктаза	Цитозоль
Аспартатаминотрансфераза Креатинкиназа Глутаматдегидрогеназа	Митохондрии
Кислая фосфатаза	Лизосомы

Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов (Табл.2). Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих цитозольную (гистидаза, аланинаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа) или мембранную локализацию (щелочная фосфатаза, g-глутамилтрансфераза), свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении ферментов митохондрий (аспартатаминотрансфераза, глутаматдегидрогеназа) или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе.

Повышение концентрации не всегда отражает повреждение ткани. Возможны другие причины:

· усиленное обновление клеток;

· клеточная пролиферация (например, опухоли);

· усиленный синтез ферментов (индукция ферментов);

· обструкция при секреции (закупорка желчных путей);

· сниженный клиренс[3] при ряде заболеваний почек.

Причинами снижения уровня нефункциональных ферментов крови являются нарушение белкового синтеза в органе (накопление тетрациклина – ингибитора синтеза белка в печени), недостаточность аминокислот (голодание или белковая недостаточность), дефицит витаминов, необходимых для синтеза коферментов (активная форма витамина В₆ - кофермент аминотрансфераз) или уменьшение числа клеток (замещение паренхиматозных клеток органа соединительной тканью при циррозе).

На уровень активности сывороточных ферментов также влияет скорость удаления их из сосудистого русла. Относительные молекулярные массы большинства внутриклеточных ферментов больше 65000, поэтому экскреция их с мочой не может играть существенной роли в удалении ферментов из крови. Молекулы некоторых ферментов, например, a-амилазы, (относительная молекулярная масса 45000), могут пройти через нормальные клубочки и экскретироваться с мочой.

Разрушение сывороточных ферментов происходит при участии протеиназ крови. В дальнейшем в выведении ферментов из сосудистого русла участвует ретикуло-эндотелиальная система.

В табл.3 представлены данные о времени циркуляции ряда ферментов в плазме крови.

Таблица 3

Период «полужизни» некоторых ферментов в плазме крови

(Комаров Ф.И. с соавт., 1999)

Название фермента	Период «полужизни»
АСТ	17±5 ч.
АЛТ	47±10 ч.
Глутаматдегидрогеназа	18±1 ч.
ЛДГ1	113±60 ч.
ЛДГ5	10±2 ч.
Креатинкиназа	15 ч.
Щелочная фосфатаза	3 - 7 дней
g-глутамилтрансфераза	3 - 4 дня
Сывороточная холинэстераза	10 дней
a-амилаза	3 - 6 ч.
Липаза	3 – 6 ч.

На представленном выше рисунке (рис.1) суммированы основные причины изменения активности сывороточных ферментов.

Рис.1. Факторы, влияющие на уровень ферментов в сыворотке (Цыганенко А.Я. с соавт., 2002).

Таким образом, энзимодиагностика основана на следующих принципах:

· при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

· количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

· активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;

· ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

· существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

1.2. Повышение специфичности энзимологических исследований

Основным недостатком использования фермен­тов в диагностике повреждения тканей является отсутствие специфичности по отношению к конк­ретной ткани или типу клеток. Многие ферменты присутствуют в разных тканях, и повышение фер­ментной активности в плазме может быть следствием повреждения любой из этих тканей.

Повышение специфичности энзимологических исследований достигается тремя путями:

Дата добавления: 2015-07-14