Выделение продуктов биосинтеза

Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуральной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культивирования, типа клеток, свойств культуральной жидкости.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифу-гирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобство этого способа - необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного удаления клеток из среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляется за счет накопления клеток на поверхности фильтра. Увеличение давления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки забивают поры, образуя менее проницаемый слой.

Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта).

Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров, поэтому универсального метода их разрушения не существует.

У грамположительных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N-ацетилглюкозамина и остатков N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками.

У грамотрицателъных бактерий клеточная стенка тоньше и покрыта снаружи слоем липидов.

Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и β-глюканов.

Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из α- и β-глюканов, гликопротеидов и хитина.

Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культивирования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, условий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген.

Химический метод разрушения клеточных стенок - обработка щелочью. Если белковый продукт не разрушается при рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток Е. coli обработкой натрия гидрокарбонатом при рН 11. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов.

Основной биохимический метод разрушения клеток микроорганизмов — лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, β-1,3- и β-1,6-глюканазой, хитиназой - или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происходит в мягких условиях.

Клетки можно разрушать физическими методами: немеханическими (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживанием-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомогенизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффективно, особенно УЗ-излучателями, генерирующими высокочастотные звуковые волны.

Дальнейшая обработка. После разрушения клеток их осколки удаляют низкоскоростным центрифугированием или микрофильтрацией через мембрану.

Белковый продукт выделяют из лизата методом высаливания — осаждением высококонцентрированными растворами нейтральных солей, чаще всего натрия- или аммония сульфатом. Седиментация белка может быть достигнута органическими растворителями (этанолом, ацетоном).

Дата добавления: 2015-07-07