Материалы и методы. Материалом для исследования служили образцы ДНК, полученные из аликвот цельной

Материалом для исследования служили образцы ДНК, полученные из аликвот цельной венозной крови от лиц, выразивших добровольное согласие на участие в проводимом исследовании, в возрасте от 14 до 109 лет (1775), татар по этнической принадлежности, из них 828 мужчин и 927 женщин, в том числе 352 лиц пожилого, 601 лиц старческого возраста и 184 долгожителей.

В исследование не включали лиц с наличием в анамнезе таких заболеваний, как инфаркт миокарда, инсульт, сахарный диабет, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз. В отношении людей старшей возрастной когорты (пожилых, стариков и долгожителей), у которых возрастное изменение функций органов сердечно-сосудистой системы является, за редким исключением, практически нормой, допускалось наличие в анамнезе атеросклероза, кардиосклероза и церебросклероза. В целом вся выборка сформирована из лиц, физически сохранных по сердечно-сосудистой и нервной системе, способных к самообслуживанию.

Выборку дифференцировали на отдельные возрастные группы согласно принятой на 7-й Всесоюзной конференции по проблемам возрастной морфологии, физиологии и биохимии классификации [Хрисанфова, 1999].

Были собраны сведения о смертности лиц старческого возраста, принимавших участие в ранее проводимых нами исследованиях (2006-2008 гг.). На момент взятия биологического материала из 399 человек в возрасте 75-108 лет, 310 человек были в возрасте 75-90 лет, 89 – в возрасте 90-108 лет. За период наблюдения умерло 100 человек в возрасте от 76 до 113 лет (СВС - средний возраст наступления смерти составил 86.8 лет), а из их числа не дожили до 90 лет 63 человека (СВС=82.74, 77-89 лет), умерли в возрасте 90-96 лет (СВС=95.3 года) 37 человек, из оставшихся в живых 50 человек достигли возраста 90-113 лет (средний возраст - 95.9 лет).

Достигли возраста долголетия и были живы в 2014 году 50 человек (90-113 лет, средний возраст 95.9 лет, медиана – 96 лет).

Забор периферической венозной крови (6-8 мл) осуществляли в пробирки с консервантом, в качестве которого использовали глюгицир (соотношение объемов крови и консерванта было 1:4). ДНК выделяли из крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1984].

Для получения информации, необходимой для выбора полиморфных по инсерции или делеции Alu -ретроэемента (Alu (I/D) участков генов, использовали геномные базы данных (TranspoGene, RepeatMasker, dbRIP). С помощью геномного браузера UCSC (http://genome.ucsc.edu) получены сведения по локализации инсерций внутри генов, их геномном контексте, фланкирующих последовательностях. С использованием программного обеспечения Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer_blast/), Primer3 software (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) осуществлен дизайн олигонуклеотидных праймеров, подбор оптимальных условий проведения полимеразной цепной реакции для исследования Alu (I/D)-полиморфизма. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации каждого Alu-элемента были подобраны с использованием 700-1200 п.о. уникальной фланкирующей последовательности фрагментов.

праймеры

Разделение фрагментов ДНК проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном или 2% агарозном гелях, гели окрашивали раствором этидия бромистого и анализировали с использованием системы гель-видеодокументации (Vilber Lormat, Франция). Чтобы избежать ошибки в определении частот генотипов, проводили два раунда генотипирования; всех гомозиготных по Alu-делеции индивидов типировали повторно.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с использованием пакетов прикладных программ GENEPOP, SPSS (v.17.0).

Соответствие закону Харди-Вайнберга проверялось с помощью программы Exact Test on Hardy-Weinberg Equilibrium (M. Freidin, 1999) и онлайн-программы Calculation for the Chi-Square Test (www.quantpsy.org/chisq/chisq.htm).

При сравнении групп по частотам генотипов и аллелей применяли точный критерий Фишера. Для поиска групп индивидов разного возраста (вне принятой возрастной периодизации), наиболее отличающихся друг от друга по распределению частот генотипов, применяли алгоритм CHAID программы Answer Tree 3.0. Для анализа результатов исследования использовали также метод бинарной логистической регрессии (оценивает вероятность наступления события в зависимости от значений независимых переменных), где в качестве зависимой переменной был выбран признак “ наличие – отсутствие генотипа”, в качестве предиктора – возраст. В целом регрессионное уравнение имеет вид: y = eZ/(1+eZ) где Z=b0+bx (b0 – константа, x – возраст, b – регрессионный коэффициент). Показатель соотношения шансов наступления события рассчитывался как OR=exp(b). Модель логистической регрессии при анализе ассоциаций генов с долголетием позволяет оценивать вероятность наблюдения генотипа как функции возраста, допуская, что частота генотипа, который влияет на индивидуальную выживаемость, может изменяться в генотипическом пуле с повышением возраста.

Дата добавления: 2015-10-28