Гены иммуноглобулинов

Индивидуальный организм здорового человека в течение жизни в B–лимфоцитах создаёт несколько миллионов вариантов АТ по способности связывать разные Аг (потенциально 10¹⁶ Аг). Никакой геном физически не несет столько отдельных структурных генов. Всего в геноме человека более 23 тыс. генов. Наследуемое от родителей количество генетического материала (ДНК), предназначенного для программирования биосинтеза АТ, не так уж и велико — всего 120 структурных генов. Это наследуемое множество генов называют зародышевыми генами иммуноглобулинов, или зародышевой конфигурацией генов.

Разнообразие генетических кодов для миллионов вариантов вариабельных участков молекул иммуноглобулинов формируется в течение всей жизни в процессе дифференцировки B–лимфоцитов: в каждом отдельном B–лимфоците происходит неповторимая рекомбинация ДНК из сегментов зародышевых генов, и трансляция РНК, и последующий синтез белка уже идут с уникального для каждого B–лимфоцита генетического кода V–области.

Феномен рекомбинации ДНК в соматических клетках, по крайней мере насколько известно современной науке, строго уникален исключительно для лимфоцитов. Подобного никто не наблюдал не только при дифференцировке каких–либо других клеток млекопитающих, но даже и каких–либо клеток иных эукариот. Соматическая рекомбинация ДНК «ниспослана» только генам антигенраспознающих молекул лимфоцитов — иммуноглобулинов в B–лимфоцитах и Рц T–клеток для Аг в T–лимфоцитах.

Этот уникальный процесс генерации разнообразия антигенраспознающих молекул внутри организма понадобился для того, чтобы многоклеточные видов с малым числом потомков сумели выжить под инфекционным давлением разнообразных земных микроорганизмов. Млекопитающие эволюционируют так медленно, что человеку трудно это даже представить. Микроорганизмы, наоборот, эволюционируют в считанные дни — недели. Так вот, лимфоциты — специальное уникальное творение природы внутри организма многоклеточных с неслучайной, но запрограммированной изменчивостью только в генах антигенсвязывающих молекул (иммуноглобулины, TCR) в количественном отношении хоть в какой-то мере сопоставимой с разнообразием микробов. Разнообразие это столь велико (например, относительно общего числа клеток в организме млекопитающего), что механизм генерации разнообразия соответствующих структурных генов мог быть (и стал) в основе запрограммированно случайным. Свойство случайности при рекомбинации соответствующей ДНК объясняет тот широко известный факт, что иммунная система «в лице» лимфоцитов распознаёт разные вещества, а не только инфекционные микроорганизмы. В естественных природных условиях инфекционные микроорганизмы в большей мере, чем другие внешние объекты, способны прорываться сквозь барьерные ткани многоклеточных. Если покровные ткани «подтекают», т.е. в силу каких–либо патологических причин, например, барьеры ЖКТ или слизистые оболочки дыхательной системы пропускают лишнее из пищи или вдыхаемых веществ, то лимфоциты распознают и реагируют на пищевые и ингаляционные Аг. Но вот к чему природа не готовила иммунную систему, так это к быстрому внедрению непосредственно во внутреннюю среду, минуя барьерные ткани, чужеродных веществ. Это чисто антропогенные деяния по парентеральным введениям, вливаниям чужой крови, трансплантациям органов. Например, трансплантат чужого органа организм реципиента отторгает, как это не покажется странным, по ошибке, которую совершают примерно 1–10% T–лимфоцитов, они принимают Аг главного комплекса гистосовместимости на чужих клетках трансплантата за свои. Если бы все 100%, а не 90% T–лимфоцитов никогда не ошибались, то чужая почка, печень, кожа, кровь и т.п. оставались бы «невидимыми» для иммунной системы.

Примерно 30 лет назад ещё методами классической биохимии, а именно аналитическим электрофорезом фрагментированной ДНК, обнаружили, что генетический материал для кодирования белков-иммуноглобулинов структурирован («разорван») на сегменты, расположенные друг относительно друга на уловимом расстоянии. Во всех клетках тела, включая стволовую кроветворную, кроме начавших дифференцировку B–лимфоцитов, гены иммуноглобулинов навсегда остаются в «разорванном» состоянии, которое называют зародышевой конфигурацией. И только в B–лимфоцитах на самом раннем этапе их специальной дифференцировки начинается сложный генетический процесс объединения сегментов ДНК, предназначенных для кодирования разных частей молекулы иммуноглобулина — V– и C–фрагментов, причём по отдельности для каждой из 3 типов полипептидных цепей — 2 типов лёгких (k и l) и тяжёлой. Это и есть феномен рекомбинации ДНК в соматической клетке. Этот феномен открыли С. Тонегава и его коллеги (1975–1976) при электрофорезе ДНК, выявившем разницу во фрагментах рестрикции ДНК из антителопродуцирующих B–лимфоцитов и из любых других не продуцирующих АТ клеток данного организма (зародышевая конфигурация).

Структура генов иммуноглобулинов подробно изучена (рис. 4.3 и 4.4). Отдельные сегменты молекулярно клонированы, определено их число. Кодирующая ДНК для вариабельной части каждой из цепей иммуноглобулина собирается из сегментов, извлекаемых из трёх отдельных кластеров: собственно V (вариабельный) (код для 95–101 АК), а также D (от Diversity — разнообразие) у тяжёлых цепей и J (от Joining — связующий) (код для нескольких АК — до 13).

Рис. 4. 3. Структура генов лёгкой цепи (L) иммуноглобулинов.

Рис. 4. 4. Структура генов тяжёлой (Н) цепи иммуноглобулинов.

Переключение синтеза изотипов иммуноглобулинов показано на рис. 4.5. Гены для k–цепи локализованы в хромосоме 2, гены для l–цепи — в хромосоме 22, гены для тяжёлых цепей всех изотипов — в хромосоме 14 (табл. 4.1).

Рис. 4. 5. Рекомбинация ДНК при переключении изотипов иммуноглобулинов B–лимфоцитов.

Молекулярные генетики группируют сегменты V–генов в несколько семейств. В одно семейство включают гены, в которых более 80% последовательности нуклеотидов гомологичны. Выделяют 7 семейств V_h, 7 семейств V_k, 8 семейств V_l. Считают, что члены одного семейства произошли от одного древнего гена путём дупликаций.

Таблица 4. 1. Число сегментов генов вариабельных областей иммуноглобулинов человека*

Кластер сегментов	Лёгкие цепи	Тяжёлая цепь
	k	l
V
D	Нет	Нет
J

* Поскольку метод молекулярного клонирования трудоемок и его выполняют всякий раз для конкретного индивидуального генома, разумно допустить, что у отдельных индивидуумов конкретное число сегментов может варьировать, но в узких пределах; также разным может быть число псевдогенов.

Рекомбинацию ДНК иммуноглобулинов катализируют специальные ферменты — рекомбиназы. Эти же ферменты катализируют рекомбинацию ДНК генов TCR в T–лимфоцитах, т.е. рекомбиназы — уникальные ферменты лимфоцитов. Но в B–лимфоцитах эти ферменты не «трогают» гены TCR, а в T–лимфоцитах не «трогают» гены иммуноглобулинов. Следовательно, до начала процесса перестройки ДНК в клетке уже существуют генрегуляторные протеины — свои у T–лимфоцитов и свои у B–лимфоцитов. Гены, кодирующие эти белки, называют мастер–генами. Они в большей степени воображаемые, чем изученные, но являются реальным объектом исследования фундаментальной науки. Субстратом для рекомбиназ служат определённые последовательности нуклеотидов в ДНК генов–мишеней (кстати, одинаковые у T– и B–лимфоцитов). Эти последовательности фланкируют (т.е. расположены с какого–либо края) каждый отдельный сегмент генов–мишеней и их называют сигнальными для рекомбинации (rss — Recombination Signal Sequencs). Rss расположены с 3'–конца V–сегментов, с 5'–конца J–сегментов и с обеих сторон D–сегментов. Последовательность нуклеотидов в rss расшифрована: консервативный гептамер CACAGTG, затем вариабельный спейсер из 12 или 23 нуклеотидов и консервативный нонамер ACAAAAACC/GGТТТТТGT. Самый первый акт расщепления цепи ДНК осуществляют два других специальных фермента лимфоцитов — гетеродимерные эндонуклеазы, кодируемые генами, называемыми RAG1 и RAG2. Последовательность нуклеотидов в гене RAG1 подобна таковой в гене дрожжей HRP–1 и в генах топоизомераз бактерий, катализирующих разрывы и сшивки ДНК, что свидетельствует о «глубинном» единстве всего живого. Но среди клеток млекопитающих RAG1 и RAG2 экспрессируются только в лимфоцитах. Репарацию разрывов ДНК катализируют по крайней мере 3 ядерных фермента: один называют аутоантигеном Ku, второй — ДНК–зависимой протеинкиназой, третий ещё недостаточно охарактеризован.

У мышей с генетическим нокаутом по любому из генов ферментов, участвующих в перестройке ДНК антигенрецепторных молекул (иммуноглобулины, TCR), лимфоциты не развиваются совсем и имеется клинический синдром тяжёлой комбинированной иммунной недостаточности — ТКИН (англ. SСID — Severe Combined ImmunoDeficiency).

В результате данной реакции рекомбинации в непрерывную последовательность ДНК соединяются по одному сегменту из V–, D– и J–областей — этот процесс называют VDJ–рекомбинацией. Вся остальная ДНК V–, D– и J–областей вырезается и выбрасывается из генома в виде кольцевых ДНК. Поэтому приобретение B–лимфоцитом в начале своей дифференцировки специфичности по потенциальному Аг происходит раз и навсегда и строго необратимо на уровне ДНК.

В каждом отдельном B–лимфоците образуетсясвоя уникальная комбинация VDJ для тяжёлой цепи и VJ — для каждой из лёгких цепей. Таким образом и подсчитали возможное число вариантов АТ по антигенной специфичности, исходя из правил случайной комбинаторики. Для k–цепи из 40 V–сегментов и 5 J–сегментов может получиться 40´5 = 200 вариантов V–области k–цепи; для l–цепи — 30´4 = 120 вариантов; всего для лёгких цепей 320 вариантов; для тяжёлой цепи 50V´30D´6J = 9000 вариантов антигенсвязывающих областей тяжёлых полипептидных цепей. В цельной молекуле иммуноглобулинов разные лёгкие и тяжёлые цепи объединяются в тетрамер также случайным образом (по крайней мере теоретически). Число случайных сочетаний из 320 и 9000 — около 3´10⁶.

Но это не всё, что обеспечивает разнообразие антигенсвязывающих областей АТ. Есть ещё два молекулярных процесса: запланированная неточность связи сегментов V–D–J и запланированный гипермутагенез именно в V–генах иммуноглобулинов. Последнее свойство — гипермутагенез — отличает гены иммуноглобулинов даже от генов TCR: у TCR есть и комбинаторика сегментов, и неточность связи V–D–J, но не выявлен гипермутагенез.

Под неточностью связи V–D–J понимают тот факт, что при формировании этих связей происходит добавление лишних некодируемых наследуемым генетическим кодом нуклеотидов. Их два «сорта»: P–нуклеотиды и N–нуклеотиды. Нуклеотиды P (от Palindromic sequences — зеркальные последовательности) возникают на концах сегментов при вырезании одноцепочечных петлей ДНК и «достройки хвостов» ферментами репарации ДНК. Нуклеотиды N (от Nontemplate–encoded — нематрично кодируемые) пристраиваются к одноцепочечной ДНК после вырезания петли специальным ферментом лимфоцитов — терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой.Этот фермент достраивает от 1 до 20 дополнительных нуклеотидов, а ферменты репарации подстраивают комплементарные пары и лигируют (ковалентно продольно состыковывают) двухцепочечную «пристройку» ДНК с двухцепочечными P–нуклеотидами. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза экспрессируется недолго и на ранних стадиях дифференцировки B–лимфоцитов. Поэтому N–нуклеотиды характерны для тяжёлых цепей, поскольку гены тяжёлых цепей перестраиваются в первую очередь. Гены лёгких цепей перестраиваются во вторую очередь, в них N–нуклеотидов уже не находят.

«Платой» за эти попытки увеличить разнообразие Аг–связывающих областей АТ, таким образом, является то, что в ²/₃ случаев добавление некодируемых нуклеотидов сдвигает рамку считывания в матричной РНК (мРНК) так, что трансляция белка становится невозможной. Это называют непродуктивной рекомбинацией генов иммуноглобулинов. Зато с учётом присоединения N– и P–нуклеотидов число пар V–генов от тяжёлой и лёгкой цепей достигает около 3500 и число вариантов антигенсвязывающих областей цельных молекул иммуноглобулинов, получающихся только в результате комбинаторики сегментов при перестройке ДНК, оказывается порядка 10¹³. Если учесть врождённые варианты V–, D– и J–сегментов, то мыслимое разнообразие и составляет около 10¹⁶, но реально меньше, так как в организме нет такого количества лимфоцитов.

Гипермутагенез, процесс возникновения точечных мутаций, происходит не под случайным воздействием космических частиц. Он запланирован и имеет место не во время лимфопоэза B–лимфоцитов в костном мозге, а во время иммуногенеза (т.е. после реально состоявшегося распознавания Аг и начавшегося иммунного ответа) и локализован в лимфоидных фолликулах периферических лимфоидных органов и тканей (лимфатических узлах, селёзенке, диффузных скоплениях). Именно гипермутагенез генов V–области иммуноглобулинов и отбор B–лимфоцитов по силе связи Ig–Рц с Аг являются механизмом возрастания аффинности АТ по мере прогрессивного развития так называемого вторичного иммунного ответа. Интенсивность гипермутаций в V–Ig в B–лимфоцитах оценивают как замену одного нуклеотида из 1000 на один митоз: каждый второй B–лимфоцит клона в зародышевом центре приобретает точечную мутацию в V–Ig. Для всей остальной ДНК явление точечной мутации реализуется с частотой на 9 порядков ниже, т.е. одна замена нуклеотида на 10¹² пар нуклеотидов на митоз.

Процессы перестройки генов иммуноглобулинов в B–лимфоците отрегулированы так, что из двух родительских хромосом в конечном счёте в одном B–лимфоците будет использован только единственный вариант как лёгкой, так и тяжёлой цепи. Это явление называют аллельным исключением. А в организме в целом разнообразие удвоено — половина от матери, половина от отца.

Описанные генетические механизмы генерации разнообразия антигенсвязывающих областей АТ имеются у человека и мышей. У животных других видов есть иные молекулярные механизмы. Например, у птиц, а также у некоторых млекопитающих (кроликов, овец) нет разнообразия зародышевых сегментов в V–области. Поэтому первично перестроенные гены иммуноглобулинов одинаковы у всех незрелых B–лимфоцитов. Такие B–лимфоциты у птиц мигрируют из костного мозга в специализированный орган — сумку Фабрициуса, где они интенсивно пролиферируют. В процессе митозов в уже перестроенных генах V–области создаётся разнообразие по механизму, называемому конверсией генов: фрагменты ДНК из перестроенной V–области одной из гомологичных хромосом обмениваются на фрагменты из неперестроенной и ранее не использованной V–области второй из гомологичных хромосом. У овец, например, наибольший вклад в разнообразие антигенсвязывающих областей АТ вносят соматические мутации, и процесс их накопления локализован в пейеровых бляшках подвздошной кишки.

Структурные гены константных частей полипептидных цепей иммуноглобулинов расположены в тех же хромосомах, что и V–, D– и J–гены, «ниже по течению», т.е. к 3'–концу от J–сегментов. Для лёгких k- и l–цепей существует по одному C–гену — С_k и С_l. «Стыковка» нуклеотидного кода для V– и C–частей лёгких цепей происходит на уровне не ДНК, а РНК — по механизму сплайсинга первичного транскрипта РНК.

Для каждого изотипа иммуноглобулинов есть свой отдельный C–ген. У человека такие гены расположены в следующем порядке, считая от J–сегмента к 3'–концу: С_m, С_d, С_g3, С_g1, eС_e (псевдоген e–цепи), C_a1, C_g2, C_g4, С_e, С_a2; у мыши: С_m, С_d, С_g3, C_g1, C_g2b, C_g2a, С_e, С_a.

Завершившие лимфопоэз B–лимфоциты любого клона по антигенной специфичности (специфичности V–области иммуноглобулина) экспрессируют иммуноглобулины только классов M и D (IgM и IgD). При этом мРНК транскрибируется в виде непрерывного транскрипта с перестроенных генов VDJ и С_m–C_d. При этом ДНК остальных C–генов других изотипов цела и невредима. В результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта РНК образуются мРНК отдельно для тяжёлых цепей IgM и IgD, которые и транслируются в белок. Этим процессом заканчивается полноценный лимфопоэз B–лимфоцитов.

Переключение же на синтез иммуноглобулинов других изотипов — G, Е, А (IgG, IgE, IgA) происходит уже в процессе развития иммунного ответа, т.е. после распознавания Аг и под воздействием определённых (в значительной мере известных на сегодня) цитокинов T–лимфоцитов и молекул клеточной мембраны T–лимфоцитов (CD40L). Существенно, что такое переключение идёт опять по механизму рекомбинации ДНК: в ДНК к ранее и единожды перестроенной комбинации VDJ присоединяется какой–либо один из C–генов тяжёлой цепи (либо С_g1, либо С_g2, либо С_g3, либо С_g4, либо С_e, либо С_a1, либо С_a2).

ДНК неиспользованных C–генов слева от использованного C–гена на этом этапе развития B–лимфоцита элиминируется в виде кольцевых структур. С этого момента судьба B–лимфоцита определена как по единственной антигенной специфичности, так и изотипу тяжёлой цепи. Если из окружения продолжают поступать регулирующие переключение изотипов сигналы, то возможен ещё акт переключения на изотип, C–ген которого «правее» в ДНК от уже экспрессированных C–генов. Если с инструкциями «покончено», B–лимфоцит вступает в терминальный этап своего развития: он становится плазматической клеткой — продуцентом больших количеств моноклонального секретируемого иммуноглобулина.

При переключении изотипа тяжёлой цепи ДНК разрывается по так называемым областям переключения SR (Switch Region), расположенным в интронах перед каждым C–геном (за исключением С_d). SR перед С_m состоит из 150 повторов последовательности [(GAGCT)3–7 (GGGGGT)]. SR перед другими C–генами отличаются в деталях, но во всех из них содержатся повторы GAGCT и GGGGGT. При переключении изотипов с ДНК работают физически другие ферменты, чем при рекомбинации VDJ (см. рис. 4.5).

Молекулы иммуноглобулина одной и той же специфичности по Аг присутствуют в организме в двух физических состояниях — в растворе и на мембране клеток и в 3 формах:

· в растворимой форме в крови и других биологических жидкостях (секретируемый клеткой иммуноглобулин);

· на мембране B–лимфоцита в составе Рц B–лимфоцитов для Аг — BCR (B–cell receptor) (трансмембранная форма иммуноглобулина). Трансмембранные формы всех классов иммуноглобулинов, включая IgM и IgA, мономеры;

· в связи с клетками, но не в трансмембранном варианте, а связанным за Fc–конец Fc–Рц клетки. В свободном виде только IgE способны быть связанными с FceRI на тучных клетках, базофилах, дендритных клетках и некоторых других типах клеток. Для остальных изотипов иммуноглобулинов характерна фиксация на Fc–Рц (FcR) на клетках только после связывания АТ с Аг, т.е. фиксируется не свободное АТ, а комплекс «Аг–АТ» через Fc–конец молекулы иммуноглобулина (на макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах).

Возвращаясь к трансмембранной и секретируемой формам иммуноглобулинов, отметим, что они различаются по своему C–концу тяжёлых цепей: в трансмембранной форме у тяжёлых цепей молекулы есть лишние 25 остатков гидрофобных АК, которые «заякоревают» молекулу в фосфолипидном бислое мембраны. Трансмембранная и секретируемые «версии» тяжёлых цепей кодируются разными экзонами соответствующих C–генов. В данном случае экзонами называют структурные гены каждого из отдельных доменов полипептидной цепи. Последний экзон каждого C–гена содержит последовательности нуклеотидов для кодирования трансмембранного участка молекулы. Первичный транскрипт РНК дифференцирующего B–лимфоцита содержит все экзоны C–гена. Трансляция белка с полноразмерной мРНК обеспечивает биосинтез тяжёлых цепей для трансмембранной формы. Но последний экзон может быть легко удалён из первичного транскрипта РНК, и тогда будет транслироваться секретируемая форма иммуноглобулина. В зрелых плазмоцитах трансмембранная форма уже совсем не синтезируется, а только продуцируется секретируемая форма.

Дата добавления: 2015-10-28