Прямая биоконверсия растительного сырья микроорганизмами

Под прямой биоконверсией понимают аэробный или анаэробный процессы переработки растительного сырья с использованием микроорганизмов без предварительной его обработки химическими или биологическими методами.

Примерами способа прямой биоконверсии растительного сырья являются процессы твёрдофазного культивирования: выращивание микроорганизмов и высших грибов на растительном сырье с целью получения биологически активных веществ, а также компостирование растительных отходов, в том числе и с калифорнийскими червями, с целью получения органических удобрений. К способу прямой биоконверсии можно отнести процесс силосования растительного сырья, а также получение кормовых белковых добавок микробиологическим путём из зерносырья. В данном разделе представлены процессы выращивания микроорганизмов, базидиальных грибов на основе целлюлозо- и пентозансодержащего сырья, а также получение кормовых белковых добавок из зерносырья.

Прямая биоконверсия целлюлозо- и пентозансодержащего растительного сырья микроорганизмами. Исследованы процессы прямой биоконверсии древесных и сельскохозяйственных отходов поверхностным и глубинным культивированием микроорганизмов, образующих ферментные системы, катализирующие расщепление целлюлозы, гемицеллюлоз, лигнина и хорошо растущих на лигноцеллюлозных материалах с целью обогащения их белком. Способ применяют в производстве целлюлолитических ферментов с использованием микроскопических грибов Trichoderma viride (Tr. reesei 18б2/КК).

В последнее время во многих странах мира возрос интерес к проблеме получения белка пищевого и кормового назначения путём культивирования различных микроорганизмов на твёрдых питательных средах, чаще всего на целлюлозосодержащих промышленных и городских отходах. Этот интерес обусловлен тем, что процесс получения белка на твёрдом питательном субстрате должен быть более экономически выгодным по сравнению с получением кормовых дрожжей на растительных гидролизатах, так как исключает дорогостоящий процесс кислотного гидролиза и ферментативного гидролиза, требующего специального получения ферментов. Получение белка непосредственно на твёрдых растительных субстратах основано на способности ряда микроорганизмов благодаря синтезу ими комплекса целлюлолитических, окислительных и других ферментов усваивать компоненты растительных материалов и накапливать белок. По использованию целлюлозсодержащих растительных материалов для непосредственного синтеза белка микроорганизмами опубликовано большое количество работ. Значительная часть их обобщена в монографии Лобанка и Бабицкой [74] и отчётах ВНИИгидролиз. В качестве продуцентов белка различные авторы использовали бактерии, актиномицеты, дрожжи и грибы. В качестве субстратов применяли отходы сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности (багасса, картофельная мезга, солома, кукурузные стебли и кочерыжка, отходы от переработки овощей), целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности, а также бытовые отходы (газеты, бумага) и т.д.

Так, были проведены исследования по обогащению хлопковой шелухи белком путём поверхностного выращивания микроскопического гриба Sporotrichum pulverulentum. Хлопковая шелуха содержит 3-4% белка, содержание белка повышалось до 13% [68].

В Индии созданы процессы превращения отхода сахарного тростника в белковый корм посредством культивирования целлюлолитических бактерий Сellulomonas sp. [68].

При изучении механизма ферментативной деструкции целлюлозы с помощью актиномимцетов Thermjmjnjspora fusca и микроскопического гриба Sporotrichum pulverulentum было показано, что субстраты, содержащие лигнин и целлюлозу высокой кристалличности, менее пригодны для утилизации и дают продукт с меньшим содержанием белка. Так, при выращивании актиномицетов на еловой древесине получен белок 14,4% (время выращивания 6 суток), в то время как на целлобиозе – 59,0%. При выращивании микроскопического гриба на порошкообразной целлюлозе с высокой кристалличностью содержание белка составило 6,0%, на древесных отходах после механического размола – 13,8%, на аморфной целлюлозе – 32%, а на целлобиозе – 40,2%.

При глубинном выращивании микроскопических грибов Бабицкой с сотрудниками [66,75] проверено около 100 культур микроскопических грибов при росте на нативной соломе и соломе, обработанной паром. Содержание белка в продукте было от 14 до 21%. Наилучшие результаты получены с грибом Trichoderma lignorium.

Авторами сделан вывод, что такие микроорганизмы, как бактерии, актиномицеты, дрожжи и плесневые грибы используют в основном для получения белка на довольно простых целлюлозосодержащих субстратах. При использовании в качестве субстрата древесины эти микроорганизмы существенно уступают высшим дереворазрушающим грибам.

Дереворазрушающие грибы часто встречаются в природе, насчитывают более 1,5 тысячи видов и делятся на две основные группы: возбудители бурой и белой гнили. Возбудители белой гнили способны глубоко разрушать лигнин, а грибы − возбудители бурой гнили разрушают, прежде всего, целлюлозу и другие полисахариды. Разрушение целлюлозы и лигнина вызвано комплексом ферментов (до 20 различных ферментов), которые выделяют дереворазрушающие грибы (раздел 3.2). Несмотря на обилие и разнообразие ферментов у грибов и их способность использовать составные элементы древесины, процессы разрушения в природных условиях идут очень медленно, достигая нескольких лет и более. Авторы считают, что главным фактором, ограничивающим скорость роста грибов, является недостаток азота в древесине. Кроме того, для питания грибов необходимо ещё элементы: сера, фосфор, калий, магний, железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций, галлий, бор, скандий, ванадий. В настоящее время научились выращивать дереворазрушающие грибы за более короткие сроки [69,76]. При поверхностном культивировании мицелия грибов (Schizophyllum commune, Coriolus pubescens, Coriolus hirsutus, Pleurotus ostreatus, Panus tigrinus) на осиновом опиле с минеральными добавками и оптимальной влажностью 65% в течение 5-21 суток растительно-грибной концентрат имел содержание белка 3,75-7,0%; при выращивании на кукурузной кочерыжке в течение 8-11 суток содержание протеина в продукте составило 5,1-8,1% [69].

Выращивание плодовых тел грибов на древесине, отходах бумажного и сахарного производства в некоторых странах известно давно. В Японии и Вьетнаме уже около 300 лет выращивают плодовые тела Lentinus edodes на древесных чурках. В Венгрии и Италии и других европейских странах выращивают плодовые тела грибов вешенка (Pleurotus ostreatus) на кукурузных стеблях, на пшеничной и рисовой соломе.

В России повсеместно выращивают вешенку на соломе, освоено производство шампиньонов на компостах, включающих солому [78]. С целью интенсификации производства грибов развивается технология подготовки субстрата с использованием ферментов. Организовано производство мицелия этих грибов в Москве − «Заречье», в Саратове − частная фирма «Сантана», в Новочеркасске − «Сатурн», в Кирове − «Ягодное» [78,79].

Мицелий базидиальных грибов является переспективным продуцентом белка. Его выращивают поверхностным и глубинным способом. Для поверхностного способа выращивания используют крахмалсодержащее сырьё − зерно. А на целлюлозо- и пентозансодержащем сырье его выращивают глубинным способом. Мицелий грибов имеет белок 36,7-44,8%. В состав белка входят все незаменимые аминокислоты, а по количеству серосодержащих аминокислот белок грибов превосходит бактериальные и дрожжевые белки. Так, в мицелии гриба Oxyphorus populinus было идентифицировано 16 аминокислот: аспарагиновая, глютаминовая, серин, глицин, треонин, аланин, валин, пролин, лейцин, β-фенилаланин, метионин, тирозин, лизин, гистидин, аргинин, триптофан. Мицелий дереворазрушающих грибов содержит в незначительном количестве нуклеиновые кислоты. Усвояемость азотистых веществ дереворазрушающих грибов может достигать 80-90%. Кроме белковых веществ в состав мицелия грибов входят углеводы [глюкоза (13,8-18,0%), Д-манноза (1,0-5,7%), ксилоза (2,0-8,0%); Д-галактоза, арабиноза и рамноза отсутствуют], витамины группы В, эргостерин, стероидные соединения, являющиеся исходным материалом для синтеза некоторых гормональных препаратов.

При глубинном культивировании мицелия грибов (Schizophyllum commune, Coriolus pubescens, Coriolus hirsutus, Pleurotus ostreatus) в суспензии опила осины (3% воздушно-сухих опилок, смешанных с минеральной средой Norkans в соотношении 1:1, рН 5,0-5,5, t=26-28^оС, в течение 7-15 суток) растительно-грибной концентрат имел содержание белка 5,0-7,4%.

Изучен химический состав образцов шести штаммов мицелия вешенки в зависимости от условий культивирования, фазы роста и состава питательной среды.

Выращенный в одинаковых условиях мицелий изученных штаммов имеет сходный общий состав: от 3 до 5% связанной воды, от 6 до 7 % водорода органических соединений, от 39 до 42 % углерода, от 6 до 9 % азота и от 4 до 6 % золы на абсолютно сухую биомассу (АСБ).

Наблюдаются общие для всех изученных штаммов вешенки закономерности в изменении содержания белка (общего и легкорастворимого) в зависимости от состава среды и фазы роста мицелия. Имеют место колебания от 12 до 50 % от АСБ. Содержание липидов в мицелии различных штаммов колеблется незначительно и составляет от 2,7 до 6% от АСБ. В составе свободных липидов обнаружены жирные кислоты с числом углеродных атомов от 8 до 20. Олеиновая кислота составляет до 56% от суммы жирных кислот. Среди насыщенных кислот преобладают стеариновая (до 24%) и пальмитиновая (до 16%). Наблюдаются определенные изменения в соотношении жирных кислот при различных условиях культивирования.

Мицелий вешенки обыкновенной, выращенный в глубинных условиях, содержит витамины группы В: тиамин – от 6 до 18; рибофлавин – от 30 до 40; ниацин – от 300 до 600, пиридоксин – от 0,4 до 1,6 и биотин – от 0,14 до 0,18 мкг/г АСБ в зависимости от штамма.

Плодовые тела высших грибов, растущих на целлюлозосодержащих субстратах, а также и их мицелий содержат вещества, обладающие лечебными свойствами. Так, сок плодовых тел шампиньонов является активным бактерицидным веществом. Известно, что при эпидемиях брюшного тифа люди, систематически питавшиеся шампиньонами, как правило, не заболевали этой болезнью. Уже более 10 лет тому назад из плодовых тел шампиньона был получен антибиотик агаридоксин, который обладает сильными бактерицидными свойствами.

Многие растущие на деревьях грибы содержат противоопухолевые активные вещества. Например, из чаги получают препарат для профилактики онкологических заболеваний. Вешенка по содержанию противоопухолевых активных веществ стоит на третьем месте после шиитаке и опенка летнего. Полисахаридые препараты на основе высших грибов широко используют в качестве биоиммунорегуляторов при многих заболеваниях.

На Западе сложилась отрасль фармацевтическая микология и сейчас там культивируют лекарственные грибы, как Lentinus edodes − шиитаке, Ganoderma lucidum − рейши, Grifola frondosa − маи-таки и т.д. Из комбинаций мицелия этих грибов, выращенного глубинным способом, получают лекарственные препараты с широким спектром действия.

По последним данным полисахаридами из лисичек, которые назвали К-10, в Германии стали лечить заболевания печени. Уже получены первые статистические данные – хорошо поддаются лечению лисичками гемангиомы печени, жировое перерождение печени, гепатит С. Aнтигельминтный препарат "Лисички" – это вытяжка хиноманнозы, губительно действующей на гельминтов, их личинки и яйца.

В Японии производят полисахаридные препараты онкостатического действия: Крестин, выделяемый из Coriolus versicolor, Лентинан − из шиитаки, Сонифилан − из Schizophyllum commune и т.д.

Лекарственные препараты из плодовых тел грибов получают в Китае. В настоящее время в китайской медицине используют около 30 видов грибов.

В Белоруссии получают лекарственный препарат на основе культуральной жидкости шиитаке. На Украине производят 16 препаратов из грибов комплексного лечебного действия [78,79].

Таким образом, в настоящее время процесс прямой биоконверсии целлюлозо- и пентозансодержащего растительного сырья целесообразно использовать с целью получения пищевого белка путём поверхностного выращивания плодовых тел базидиальных грибов и глубинного выращивания их мицелия на прозрачных субстратах, атакже с целью получения лекарственных препаратов на их основе.

Прямая биоконверсия крахмалсодержащего сырья. Процесс прямой биоконверсии крахмала, муки и зерносырья различных видов, картофельной мезги при глубинном и поверхностном культивировании мицеляльных грибов и актиномицетов используют в промышленном производстве для получения ферментов, антибиотиков и других биологически активных веществ. Длительность процессов (до 5 суток) является их основным недостатком.

С целью снижения затрат на производство продукции микробиологической промышленности (кормового белка и спирта) ведутся научно-исследовательские работы по прямой биоконверсии крахмалсодержащего сырья в направлении подбора микроорганизмов.

Для биоконверсии пшеницы и пшеничных отрубей авторы [114] использовали смеси культур: 1) Lipomyces kononenkoае ИНМИА 10093, обладающую амилолитической активностью, и Candida scottii ИНМИА 10208; 2) Schwanniomyces alluvius ИНМИА 10198, обладающую амилолитической активностью, и Candida scоttii ИНМИА 10208. После выращивания микроорганизмов биомассу центрифугировали и определяли содержание белка по Барнштейну. При биоконверсии отрубей он составил 13-14%, а при биоконверсии пшеницы – 30-31%.

В АН Латвии разрабатываются методы твёрдофазной ферментации пшеничных отрубей с целью их обогащения кормовым белком [72]. При использовании дрожжей Endomycopsis fibuligera и бактерий Brevibacterium (время роста 24-35 часов) получен препарат с высоким содержанием лизина, глюкоамилазной активностью и содержанием белка 12,4%.

Проведена твёрдофазная ферментация фуражной муки грибом Polyporus speamosus. Получен продукт с содержанием белка 15%.

Имеются данные по прямой ферментации смеси муки и спиртовой барды ассоциацией дрожжей Saccharomycоpsis fibuligera ВСБ-12 и бактерий Rhodococсus erhytropolis ВСБ-655. Добавление муки в количестве 6% к спиртовой барде позволило получить продуктивность процесса 6,8-7,5 кг/м³. Содержание протеина в концентрированной барде составило 47-48% [89].

В Институте микробиологии АН Белоруссии разработана технология получения препаратов микробного синтеза на основе отходов переработки картофеля: дигитатина и нотатина. Название продукты получили от наименования продуцентов белка Penicillium digitatum и Penicillium notatum [72]. Питательный субстрат содержал клеточный сок картофеля и мезгу (а.с.в. 2-3%). При времени ферментации 48-72 ч содержание сырого протеина в продуктах составляет 44,9 и 55,0%, а белка - 36,2 и 43,8% соответственно.

Индийские специалисты выделили из природных источников новый вид дрожжей, идентифицированный как Saccharomyces diastaticus. Он отличается от других видов активностью и способностью к ассимиляции, осахариванию и сбраживанию крахмала.

Штаммы S.cerevisiae ВR Q 530 и BR Q 536 являются мейотическими сегрегантами штамма S.cerevisiae NCY C 361. Все три штамма продуцируют внеклеточную глюкоамилазу. Штамм Lypomyces kononenkoae CB S 2514 можно использовать для прямого получения дрожжевой биомассы из отходов, содержащих крахмал. Он продуцирует альфа-амилазу и глюкоамилазу. Из этих четырёх штаммов наиболее эффективным оказался S.c.BR Q 530. Биомасса штамма содержала 41% белка.

С целью интенсификации процесса прямого сбраживания крахмала используются также гибридные штаммы [80,81]. Так, штамм S.cerevisiae Y-717 способен сбраживать простые углеводы и выделять в среду ферменты, гидролизующие крахмал. Применение этого штамма снижало расход фермента ГХ-466 в 2 раза на фоне нормативного расхода солода (5,6%). Кроме того, время брожения сокращалось до 55 часов.

Cпециалисты Японии разработали способ прямой биоконверсии крахмалсодержащего сырья клетками дрожжей S.cerevisiae, включающих модифицированный ген глюкоамилазы Rhizopus. От исходного штамма QD-1902 традиционным путём получен гаплоидный штамм Q-1315, сохранивший высокую ферментативную активность и способность к трансформации дрожжевыми плазмидами. Его производные трансформанты Q-3315 и Q-2315 обладают глюкоамилазной активностью [82].

Как мы видим, при прямой биоконверсии зерносырья (отруби, нестандартное зерно) большой интерес представляет использование в качестве основного продуцента белка дрожжей сахаромицетов. Воробьёва и Сушкова [33,64] для разработки процесса прямой биоконверсии зерносырья использовали штамм дрожжей S.cerevisiae (diastaticus) ВКПМ Y-1218, обладающий амилолитической активностью.

Изучены закономерности роста данного штамма в течение 16 ч на синтетических средах с различными источниками углерода. Результаты исследований представлены в таблице 3.5.

3.5. Результаты исследований эффективности ассимиляции различных углеводов штаммом дрожжей S.cerevisiae (diastaticus) ВКПМ Y-1218

Источник углерода	Т, ^оС	РВисх, %	РВост, %	Концентра- ция дрож- жей, г/дм^3	Степень биоконвер- сии, %
б/инвер-сии	с/инвер-сией	б/инвер-сии	с/инвер-сией
Глюкоза		1,85	-	0,045	-	35,8	97,5
	2,05	-	0,087	-	24,2	95,7
Ксилоза		1,96	-	1,32	-	25,4	32,7
	1,96	-	0,95	-	28,9	51,5
Сахароза		-	1,90	0,079	0,4	43,6	78,95
	-	1,90	0,049	0,4	29,3	78,9
Крахмал		0,121	1,87	0,057	0,8	-	55,6
	0,121	2,12	0,048	1,2	-	42,5
Крахмал отрубей		0,58	2,48	0,086	0,9	-	60,5
	0,58	2,48	0,057	1,0	-	56,5

Как видно из представленных данных, по снижению скорости ассимиляции углеводов их можно расположить в следующей последовательности: глюкоза, сахароза, крахмал отрубей, водорастворимый крахмал, ксилоза. Выращивание культуры при интервале температур 28-37^оС не оказывало существенного влияния на скорость ассимиляции глюкозы и сахарозы. С повышением температуры скорость потребления пентоз увеличивается и при температуре 37^оС составляет 51,5%, а скорость потребления крахмала снижается.

Кинетические кривые ассимиляции РВ и РВИ пульпы отрубей представлены на рисунке 3.14.

При построении кинетических кривых по ассимиляции углеводов отрубей использовали данные опытов с пульпой следующего состава: РВИ=4,98%, РВ=1,95%, N₂=1000 мг/дм³; режим ферментации: рН 4,5-5,0, t=32-34 ^оС, n=150-170 об/мин, засев дрожжей 5 г/дм³.

Из анализа кинетических кривых следует, что время ассимиляции моносахаридов и углеводов более сложного состава пульпы отрубей составляет 10-20 ч.

Прямая биоконверсия зерносырья в промышленном производстве. Прямую биоконверсию зерносырья используютв промышленном производстве кормовых белковых добавок. Производство кормовых белковых добавок на основе отходов мукомольной промышленности организовано на Башкирском биохимическом заводе (торговое название «Биотрин» ТУ 9291-001-00479994-95) и в Белоруссии на Новополоцком заводе БВК (торговое название «Провит»).

Принципиальная технологическая схема производства кормовых белковых продуктов на основе отрубей на всех заводах одинакова и включает в себя следующие стадии:

1. Подготовка питательного субстрата: измельчение зерносырья, термообработка суспензии зерносырья с гидромодулем 1:3,8-1:4; добавление питательных солей: мочевины, сульфата аммония, хлорида калия, и микроэлементов: Мg, Fe, Mn и др.; охлождение субстрата.

2. Накопление биомассы дрожжей в аппаратах отделения чистой культуры.

3. Ферментация в биореакторе с эжекционной системой воздухораспределения (Б-50 и АДР-900).

4. Плазмолиз биосуспензии при t=80-90^оС и сушка на сушилках СРЦ-12,5.

5. Упаковка в клапанные мешки или грануляция и складирование в силосах.

Кормовые белковые добавки, получаемой по данной технологии, содержат сырой протеин в количестве 40,8-45% и белок до 25%. Исследован полный состав питательной ценности продукта [84-88]. Данные кормовые белковые добавки на основе зерноотходов прошли испытания на эффективность скармливания птице, КРС (телятам), свиньям и норкам. Во всех случаях получены положительные результаты.

На Кировском биохимическом заводе была разработана и создана отдельная технологическая линия получения кормового белкового продукта из зерносырья. Подготовка зерносырья с целью прямой биоконверсии сводилась к его термообработке и измельчению в роторно-пульсационном аппарате (РПА) [33].

В промышленных условиях была проведена проверка прямой биоконверсии зернового субстрата дрожжами Saccharomyces cerevisiae (diastaticus) ВКПМ-1218 при глубинном выращивании в ферментаторах с реконстуированной эрлифтной системой воздухораспределения.

Наиболее высокие показатели при непрерывной биоконверсии были получены при следующих технологических параметрах: содержание сухих веществ в зерновой пульпе в пределах 8,5-9,5% и в биосуспензии – 7-7,5%, содержание в исходной пульпе РВИ=4,5-5,2%, общего азота – 2400-2600 мг/дм³, минерального азота – 40-140 мг/дм³, фосфора (Р₂О₅) – 200-400 мг/дм³.

По полученным результатам построена зависимость степени биоконверсии РВИ пульпы отрубей от времени выращивания (рисунок 3.15).

Из полученной зависимости видно, что максимальная степень биоконверсии (64%) достигается при времени выращивания 18,5-19,5 ч.

При биоконверсии водной пульпы пшеничных отрубей наработана партия кормового продукта в количестве 151,99 т с содержанием сырого протеина 36,1% и белка 25,6%.

Препарат «Рекицен − РД» − это ферментированные штаммом дрожжей Saccharomyces vini γ-516 отруби, не содержащие живых микроорганизмов. Производят препарат в ЗАО «Ягодное» Кировской области. Препарат рекомендован в качестве источника пищевых волокон, витамина В₁ и минеральных веществ. Качество «Рекицена − РД» должно соответствовать требованиям ТУ 9295-003-05344371-2005. «Рекицен − РД» контролируют по адсорбционной активности (не менее 20 мг/г), влажности (не более 7%) и санитарно-гигиеническим показателям (микробиологическая чистота, тяжёлые металлы, пестициды и др.).

Технология производства препарата «Рекицен − РД» состоит из следующих стадий: подготовка посевного материала, подготовка питательного субстрата, ферментация, сушка, дробление, фасовка и упаковка. Технология основана на твёрдофазном культивировании дрожжей на влажных отрубях (разработчик Кировский НИИ микробиологии).

Штамм дрожжей Saccharomyces vini γ-516 хранят в пробирках с агаризованным суслом. Для подготовки культуры к засеву её активируют путём пересевов около 10 раз в пробирках через 1-2 суток. Культуру дрожжей размножают вначале на агаризованном сусле, а затем на питательном стерильном субстрате из отрубей. Подготовленный посевной материал делят на две части. Одну часть используют для размножения посевного материала, а другую − для получения продукта. Для подготовки питательного субстрата отруби смешивают с водой (до влажности 47-60%). Питательный субстрат смешивают с посевным материалом. Подготовленную смесь отрубей и культуры дрожжей помещают в кюветы полочного термостата. В термоставт подают сжатый подогретый воздух. Температуру (30^оС) в термостате поддерживают путём изменения температуры и расхода воздуха. Ферментируемую массу периодически перемешивают. По окончании процесса ферментации (18 ч) ферментируемую массу переносят на поддоны в полочную сушилку. Температуру в процессе сушки изменяют от 300 до 80^оС. Влажность готового продукта не должна превышать 10%. Высушенный продукт дробят на дробилках. Фасовку и упаковку «Рекицена − РД» осуществляют в соответствии с ТУ 9295-003-05344371-2005.

Дата добавления: 2015-10-02