IV. Векторы E. coli на основе нитевидных фагов

К нитевидным фагам относятся фаги M13, fd, f1. Они содержат кольцевую одноцепочечную ДНК, и поэтому применяются в экспериментах, где необходимо клонирование именно одноцепочечной ДНК.

Вирусные частицы имеют форму палочек длиной 900 нм и диаметром 7 нм, содержат ДНК длиной 6.4 т.п.н. (+-цепь), упакованную в трубочку из 2700 копий основного оболочечного белка, закрытую на концах минорными оболочечными белками. Нитевидные фаги присоединяются к концам F-пилей E. coli, и поэтому могут инфицировать только F+-клетки бактерий. После прикрепления ДНК переносится в цитоплазму клетки. Бактериальная ДНК-полимераза осуществляет синтез второй, – -цепи, образуя двухцепочечную репликативную форму (РФ) фагового генома. Синтез второй цепи начинается в области ori ^–. В области ori ^– образуется разрыв +-цепи, и, таким образом, фаговая ДНК реплицируется по модели «катящегося кольца». Репликативная форма образует 200-300 копий на 1 клетку. Сборка и выход вирусных частиц наружу (экспорт) происход с помощью белков клеточных мембран хозяина, через специальный экспортный канал, а лизиса клетки не происходит. Умножение ДНК вируса и синтез его белков забирает «силы» клетки, и поэтому инфицированные бактерии растут на 25-50% медленнее, чем незараженные. В результате на бактериальном газоне образуются мутные бляшки.

Гибридный фаг M13, применяемый как клонирующий вектор, содержит искусственно введенные фрагменты генов расщепления лактозы. Один из них кодирует комплиментарную субъединицу белка, дополняющую субъединицу, кодируемую бактериальной клеткой. Фенотип транформированных клеток при этом меняется с Lac^– на Lac⁺. Отбор гибридных клонов производится на газоне E. coli, на агаризованной среде, содержащей хромогенное соединение бромкрезоловый пурпурный (Xgal). Для расширения возможностей клонирования в ДНК фага M13 встроили синтетический полилинкер, содержащий по 2 места действия для 5 рестриктаз, и получили таким образом фаговый вектор M13mp7. Встройка данного полилинкера не нарушила ген, ответственный за комплиментацию признака расщепления лактозы – таким образом, фенотипический маркер сохранился.

Дата добавления: 2015-08-27