III. Векторы E.coli на основе фага лямбда

К моменту появления методов генетической инженерии фаг лямбда был наиболее полно изучен с точки зоения молекулярной биологии, по сравнению с дургими вирусами бактерий. Первые векторы на основе фага λ появились в 1974 г.

Штамм бактерии, лизогенный по какому-то умеренному фагу, обозначают по принципу: E. coli С600(λ с I₈₅₇), где в скобках – штамм лизогенирующего фага. Геном фага λ можно разделить на 3 основные части:

(1) сектор, включающий все гены (от Nu 1 до J), белковые продукты которых необходимы для формирования капсида и упаковки в них молекул ДНК.

(2) сектор между J и N несущественен для литического развития фага. Этот сектор содержит ген, участвующие в сайтспецифической интеграции ДНК фага в бактериальную хромосому (int) и исключение профага из хромосомы (xis).

(3) Сектор остальных контролирующих элементов, включая гены, необходимые для репликации фаговой ДНК (O и P) и для лизиса клеток (S и R).

Район GC-богатых липких концов, длиной по 12 нукл. (cos R и cos L) называется cos -сайтом.

При размножении фага в клетке, его ДНК находится в конкатемерной форме – т.е. несколько полных фаговых геномов соединены в одну молекулу ДНК. Белки Nu1 и А связываются с cos-сайтами на такой конкатемерной молекуле и обеспецивают ее нарезание на одельные геномы, с образованием «липких» концов. ДНК пакуется в головку, а затем происходит присоединение хвостового отростка.

В геноме фага λ и имеется 5 мест расщепления для Eco RI, причем 3 из них находятся в области генов, несущественных для литического развития фага. Для Hin dIII имеется 6 мест узнавания, их них 5 – в области, несущественных для развития фага.

Встройка фрагментов чужДНК по сайтам рестрикции ограничена размером генома фага: жизнеспособность «гибридного» фага резко снижается, если размер его ДНК составляет более 105 или менее 78% размера ДНК фага дикого типа. Размер ДНК гибридных фагов должен находиться в пределах 38-51 т.п.н.

Упаковка ДНК фага лямбда в капсид in vitro. При использовании фага лямбда в качестве вектора часто применяют способ искусственной упаковки первоначально голой ДНК в капсиды. При этом берется ДНК мутантов фага, не способных образовывать полноценные фаговые частицы, т.к. имеют дефекты генов, кодирующих белки капсида. Ее смешивают с белковыми экстрактами клеток, в которых развивался фаг. В результате этого происходит самосборка инфекционных частиц, при которой незадействованные (пустые) капсиды с помощью ферментов фага включают фаговую ДНК. Значение этого метода в том, что в капсид упаковываются только молекулы ДНК, размер которых приблизительно равен размеру фагового генома. Побочные генно-инженерные продукты в капсид не упаковываются.

Векторы на основе λ делят на векторы внедрения и векторы замещения.

Векторы внедрения имеют на ДНК одно место действия для данной рестриктазы. Если при встройке экзогенной ДНК в этот сайт происходит нарушение какого-нибудь исходого гена, отбор гибридных клонов идет как процесс выявления соответсвующих фаговых мутаций.

Пример: векторный фаг λp lac 5-1. При встройке экзогенной ДНк по единственному месту действия Eco RI нарушается ген β-галактозидазы (lac Z), и это легко детектируется в тесте титрования фагов на газоне E.coli lac Z^- (штамм, не способный сбраживать лактозу) на чашках с индикаторным красителем. β-галактозидаза катализирует расщепление лактозы на глюкозу и галактозу, что приводит к закислению окружающей среды. Изменение pH выявляется на питательной среде с лактозой и краистелем бромкрезоловым пурпурным. Исходный фаг λp lac 5-1 сбраживает лактозу, и бляшки, образуемые им, имеют желтое окрашивание. Гибридные фаги на основе λp lac 5-1 теряют β-галактозидазную активность, и формируют бляшки без изменения цвета.

Векторы замещения имеют 2 или более мест действия рестриктаз на молекуле фаговой ДНК.

Векторы замещения 1-го поколения. Заключенный между местами рестрикции фрагмент векторной ДНК замещается экзогенной ДНК. При этом происходит удаление нескольких генов фага, что детектируетс генетическими методами. Удаляться могут только гены, несущественные для литического развития фага (область от J до N).

Пример: вариант фага λ, в который можно встраивать фрагменты размером до 24 т.п.н., что составляет примерно ½ всей гибридной фаговой ДНК.

Векторы замещения 2-го поколения. У них замещаемые фрагменты ДНК с двух сторон ограничены искусственными полилинкерами, содержащими участки узнавания нексольких различных рестриктаз. Например, широко используется в лабораториях векторный фаг λEMBL12, содержащий в полилинкерах места узнавания для 6 рестриктаз.

Векторы замещения 2-го поколения позволяют встраивать фрагменты размером до 23 т.п.н. (1 т.п.н. идет на полилинкеры). Это дает возможность создавать на их основе библиотеки генов (= клонотеки, = геномных библиотеки). При этом геном изучаемого организма расщепляется на фрагменты «средне» щепящими рестриктазами (обычно Sau 3AI и Mbo I). Перед встройкой в ДНК фага полученных фрагментов, среди них отбирают только фрагменты протяженностью 15-20 т.п.н., путем электрофоретического фракционирования. Таким образом избегают встройки в ДНК фага двух или более несоседних в геноме фрагментов. При встройке 2 и более фрагментов размер гибридной ДНК будет превышать предельно допустимый: удобным инструментом при этом является упаковка ДНК в капсид. При упаковке ДНК в капсид in vitro произосходит отбор гибридных молекул размером от 38 до 51 т.п.н.

Фрагменты ДНК в клонотеке можно идентифицировать по их порядку расположения в геноме, и при условии последовательного покрытия всего генома, такое собрание штаммов фага лямбда называют энциклопедией генов. Для этого используют векторы замещения 2-го поколения типа λDASH. Как оказывается, число клонов гибридной ДНК в энциклопедии гораздо меньше, чем в библиотеке, т.к. исключены крупные участки перекрывания и разного рода посторы. Например, для создания полной энциклопедии генов E. coli пришлось проанализировать 3400 гибридных клонов, а уже сформированная энциклопедия содержит 381 клон. Тем не менее, хранение целых генов в фаговых векторах не всегда возможно, т.к. многие гены гораздо длиннее, чем 23 т.п.н.

Дата добавления: 2015-08-27