Действие ультрафиолетового излучения на биологические мембраны.

Нативные биологические мембраны отличаются низкой проницаемостью для заряженных молекул и ионов. Это свойство позволяет им выполнять в клетках функцию барьера, с одной стороны, отделяющего внутриклеточную среду от внеклеточной, а с другой – разделяющего внутриклеточный объем на отдельные «отсеки», характеристики внутри которых (например, величина рН) могут быть различны.

Известно, что ультрафиолетовое излучение способно ухудшать барьерные функции биологических мембран. Прежде всего, под действием излучения увеличивается их ионная проницаемость. Способность ультрафиолетового излучения увеличивать ионную проницаемость биологических мембран показана на клетках самых разных типов (клетках дрожжей, водорослей, простейших, яйцеклетках морского ежа и т.д.). Данный эффект не определяется фотоповреждением нуклеиновых кислот, поскольку у целого ряда клеток после облучения, несмотря на увеличение проницаемости мембран, сохраняется способность к нормальному размножению. Кроме того, увеличение ионной проницаемости вследствие УФ облучения наблюдается и у безъядерных клеток, например, у эритроцитов. В этих клетках после облучения регистрируется выход из цитоплазмы в среду инкубации ионов К⁺ и вход извне в клетки ионов Na⁺. Как следствие, у эритроцитов нарушается осмотический баланс между цитоплазмой и внеклеточной средой, они набухают и лизируют (развивается фотоиндуцированный гемолиз).

Показано также, что УФ излучение может вызывать увеличение ионной проницаемости и у мембран внутриклеточных органелл, таких, как митохондрии или лизосомы.

Из компонентов клеточных мембран наиболее восприимчивы к действию УФ излучения остатки ненасыщенных жирных кислот (олеиновой, линолевой, линоленовой, арахидоновой и т.д.), входящие в состав фосфолипидов, формирующих липидный бислой мембраны. Ненасыщенные жирные кислоты и их остатки в составе фосфолипидов содержат двойные связи (-CH=CH-), которых может быть от 1-й до 6-ти. Нужно заметить, что эти связи не являются сопряженными и всегда разделены метиленовыми группами (-СН₂-). Поэтому область собственного поглощения ненасыщенных жирных кислот лежит в коротковолновой части ультрафиолетовой области спектра, при l <220 нм. Соответственно, прямое фотохимическое повреждение этих кислот возможно только при действии на них именно такого излучения. Если же на мембрану действует более длинноволновое УФ излучение (например, с l >240 нм), повреждение липидов оказывается возможным только в результате эффекта фотосенсибилизации. Фотосенсибилизацией называется явление, при котором акцептором фотонов является один тип молекул, а энергия поглощенных квантов реализуется в преобразовании молекул другого типа. Перенос энергии поглощенных квантов с молекул-фотосенсибилизаторов на молекулы-мишени может происходить разными путями. Поскольку явление фотосенсибилизации активно используется в фотомедицине, мы рассмотрим его более подробно ниже, в соответствующей главе.

Ненасыщенные жирные кислоты и их остатки в составе мембранных фосфолипидов легко окисляются в присутствии кислорода. В ходе этого окисления кислород присоединяется к углеродному атому, соседнему с двойной связью, например, к углеродному атому метиленовой группы. В результате формируется перекись жирной кислоты. Это окисление носит характер цепного свободнорадикального процесса. Для его запуска (инициации) требуется присутствие в системе свободных радикалов. Важной особенностью процессов данного типа является то, что, взаимодействуя с молекулами объекта, эти свободные радикалы не исчезают, а формируют другие свободные радикалы. Ниже приведена общая схема химических процессов, сопровождающих цепное свободнорадикальное окисление ненасыщенных жирных кислот и их остатков в составе фосфолипидов клеточных мембран.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 135.

Окисление начинается с инициирования цепей (на схеме – стадия (0)). Инициирующими свободными радикалами могут быть радикалы воды, радикалы аминокислот и т.д. После инициации процесс переходит в стадии продолжения ((1) и (2)) и разветвления ((3)) цепей окисления. Разветвление цепей обусловлено распадом формирующихся липидных гидроперекисей с образованием свободных радикалов, инициирующих новые цепи окисления. Распад липидных гидроперекисей может протекать и спонтанно, но его скорость резко увеличивается в присутствии ионов Fe²⁺ и под действием УФ излучения.

Некоторая часть радикалов RO₂^· и R^· рекомбинирует друг с другом, формируя неактивные продукты окисления (на схеме – (4), (5) и (6)). Такой обрыв цепи окисления называется спонтанным. Помимо спонтанного обрыва цепи, свободнорадикальное цепное окисление ненасыщенных жирных кислот может прерываться липидными антиоксидантами. Из них наиболее распространен a-токоферол, который уже в относительно низкой концентрации (в экспериментальных моделях – порядка 10^{-6 М) значительно ослабляет рассматриваемое цепное окисление. Заметим, что при этом образуются свободные радикалы самого} a-токоферола, которые, однако, малоактивны и новых цепей окисления не генерируют. Впрочем, если таких радикалов накапливается много, возможна инициация процесса окисления радикалами антиоксиданта (на схеме – реакции (10)¸(12)).

Нужно заметить, что a-токоферол обладает выраженным максимумом поглощения при 292 нм и при действии на него излучения в указанном спектральном диапазоне подвергается фотолизу (реакция (13) на схеме). Фотолиз антиоксиданта приводит к тому, что реакции (7) и (8) перестают протекать, в результате чего процесс окисления ненасыщенных жирных кислот ускоряется.

Важно заметить, что реакция (6) на приведённой схеме приводит к образованию продукта, находящегося в электронно-возбужденном состоянии. Поэтому ее протекание сопровождается испусканием квантов хемилюминесценции. Эта особенность процесса цепного свободнорадикального окисления ненасыщенных жирных кислот позволяет использовать хемилюминесцентный анализ при диагностике состояний, сопровождающихся активацией такого окисления в органах и тканях (см. ниже).

Из приводимой схемы следует, что, будучи окислительным процессом, протекающее под действием УФ излучения окисление ненасыщенных жирных кислот и их остатков в составе мембранных фосфолипидов зависит от наличия кислорода в зоне развития процесса. Однако, некоторые стадии, например, стадия (3), от присутствия кислорода в системе не зависят.

Доказательством цепного характера фотоокисления липидов служат следующие факты:

• квантовый вход накопления продуктов процесса оказывается чрезвычайно высоким, значительно больше 1. Например, квантовый выход фотохимического формирования перекисей этиллинолеата в моделях оказывается равен 90.
• Для процесса фотоокисления ненасыщенных липидов характерно последействие. Иными словами, вызванное УФ облучением окисление липидов в образцах продолжает протекать и по окончании действия излучения, причем иногда в течение нескольких часов.

В качестве фотосенсибилизаторов процесса фотоокисления липидов могут выступать не только хромофоры белков и других эндо- и экзогенных соединений, но и продукты самого процесса. Дело в том, что в ходе окисления в жирнокислотных остатках появляются так называемые диеновые конъюгаты, системы из двух сопряженных двойных связей, обладающие собственным поглощением с максимумом при 233 нм. Могут также появляться триеновые конъюгаты (максимум поглощения при 260-280 нм) и более сложные системы из сопряженных двойных связей. Кроме того, распад перекисей липидов сопровождается появлением продуктов кетоновой и альдегидной природы с максимумом поглощения около 270 нм. Наиболее известен уже упоминавшийся выше малоновый диальдегид, который при взаимодействии с 2-тиобарбитуровой кислотой формирует хромофор с максимумом поглощения при 532 нм. Но имеются и другие продукты окисления липидов, сами по себе поглощающие свет видимой области спектра. Их присутствие придаёт растворам сильно окисленных липидов желтоватую окраску.

Поскольку разные продукты окисления ненасыщенных липидов подвергаются фотолизу при поглощении излучения в разных спектральных диапазонах, состав накапливающихся в образцах продуктов зависит от спектрального состава излучения, вызывающего это окисление. Этот факт можно подтвердить данными, представленными на рис. 30.

Рисунок 30. Спектры поглощения растворов липидов мозга крыс в гептане. (1) Необлученные липиды. (2) Липиды после облучения полным спектром излучения ртутно-кварцевой лампы высокого давления (содержит кванты с l от 239 нм и длиннее) в присутствии О₂. (3) Липиды после облучения таким же излучением в отсутствие О₂. (4) Липиды после облучения излучением с l >300 нм в присутствии О₂. (5) Те же липиды, спектр поглощения которых представлен кривой 4, после дополнительного облучения излучением в спектральном диапазоне от 239 нм в отсутствие О₂.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 137.

При облучении растворов липидов полным спектром излучения ртутно-кварцевой лампы высокого давления, содержащим кванты с длинами волн от 239 нм и длиннее, в растворе формируются все перечисленные выше продукты фотоокисления ненасыщенных жирнокислотных остатков (рис. 30, кривая 2). Если же для облучения используется излучение этого же источника, но в области l длиннее 300 нм, в растворе будут накапливаться диеновые конъюгаты (рис. 30, кривая 4). Если затем облучить такой образец излучением с l» 240 нм, накопившиеся конъюгаты распадаются с образованием кетонов и альдегидов, поглощающих в более длинноволновой области (рис. 30, кривая 5). Важно заметить, что фотолиз диеновых конъюгатов не зависит от наличия кислорода в среде. Но, если кислород в образце отсутствует с самого начала, до облучения, накопления продуктов фотоокисления липидов в ходе воздействия излучения наблюдаться не будет (рис. 30, кривая 2). Эта особенность отличает фотохимическую окислительную модификацию липидов от фотохимической модификации белков и нуклеиновых кислот, которые подвержены фотоинактивации вне зависимости от наличия кислорода в системе.

Поскольку в состав биологических мембран помимо липидов входят и другие соединения, облучение таких мембран будет сопровождаться фотохимическими изменениями сразу нескольких типов. Во-первых, будет протекать прямая фотохимическая модификация мембранных белков, связанная с фотолизом в них ароматических аминокислотных остатков и серосодержащих групп. Во-вторых, будет наблюдаться фотодеструкция ряда кофакторов ферментов, таких, как пиридиннуклеотиды, флавины, кофермент Q, геминовые соединения. Наконец, в-третьих, будет протекать и окислительное фотоповреждение липидов в составе липидного бислоя мембран (многие продукты которого сами по себе химически достаточно активны и могут косвенно повреждать мембранные белки). Все эти процессы обязательно отражаются на выполнении биологической мембраной своих функций. Прежде всего, они приводят к тому, что увеличивается проницаемость этой мембраны для ионов. Как результат, у нервных и мышечных клеток нарушается возбудимость, в митохондриях блокируется синтез макроэргических соединений, почти у всех клеток изменяется осмотическое равновесие между цитоплазмой и окружающей средой. Рассмотрим несколько примеров того, как ослабление барьерной функции биологических мембран сказывается на состоянии клеток и их органелл.

Еще в 20-х годах прошлого века было установлено, что облучение небольшого участка поверхности неоплодотворенной яйцеклетки морского ежа пучком излучения диаметром 1 мкм и с длиной волны 280 нм приводит к локальному увеличению ионной проницаемости мембраны яйцеклетки для ионов щелочных металлов. В результате наблюдалась сначала локальная (в зоне облучения), а затем - генерализованная перестройка характеристик мембраны, аналогичная той, которая в нормальных условиях происходит после оплодотворения яйцеклетки. Как следствие, облученная неоплодотворенная яйцеклетка начинала делиться и развиваться, несмотря на отсутствие сперматозоидов. Иными словами, излучение в данном случае служило фактором, инициирующим партеногенетическое развитие неоплодотворенной гаметы.

УФ облучение инфузорий-туфелек (парамеций) приводило к тому, что клетки этих простейших набухали и гибли из-за утраты способности к поддержанию осмотического равновесия между цитоплазмой и водным окружением.

Облучение возбудимых мембран нервных волокон сопровождалось падением амплитуды потенциала действия и ростом порога возбудимости при электрическом раздражении. Кроме того, у облученных мембран было отмечено некоторое снижение величины потенциала покоя.

Еще в 50-х годах прошлого века было показано, что УФ облучение клеток дрожжей приводит к набуханию митохондрий внутри этих клеток. Осуществленные позже наблюдения за функцией изолированных митохондрий после УФ облучения показали, что излучение вызывает увеличение проницаемости мембран этих органелл для протонов. В результате окисление субстратов и синтез АТФ в митохондриях разобщаются.

Достаточно удобной моделью для изучения влияния ультрафиолетового света на ионную проницаемость клеточных мембран являются эритроциты. Эти клетки в норме находятся в состоянии относительного коллоидно-осмотического равновесия, поскольку осмотическая сила, создаваемая присутствующим в их цитоплазме в высокой (около 5 мМ) гемоглобином компенсируется градиентами концентраций ионов Na⁺, K⁺ и Cl^-, создаваемыми за счет работы К⁺,Na⁺-АТФаз. Что касается анионов Cl^-, то проницаемость для них у эритроцитарных мембран примерно в 10⁶ раз больше, чем проницаемость для одновалентных катионов, поэтому их распределение между средой инкубации и цитоплазмой эритроцитов определяется принципами электронейтральности. Общая концентрация ионов в солевой среде инкубации эритроцитов в результате работы АТФаз оказывается выше, чем в цитоплазме клеток, что и приводит к компенсации осмотического (правильнее сказать – онкотического) давления, создаваемого внутриклеточным гемоглобином.

При УФ облучении пассивная ионная проницаемость эритроцитарных мембран увеличивается, а активность катион-транспортирующих АТФаз – падает. Из-за этого существующие ионные трансмембранные градиенты начинают исчезать. Ионы К⁺ при этом выходят в среду инкубации клеток, а ионы Na⁺ - в клеточную цитоплазму. Подвижность ионов К⁺ несколько выше, чем ионов Na⁺. Поэтому изначально эритроциты даже несколько снижают свой объем (сжимаются). Но со временем ионные градиенты полностью исчезают и перестают компенсировать онкотическое давление гемолобина, направленное изнутри клетки наружу. Сам же гемоглобин через мембрану транспортироваться не может – размер дефектов в эритроцитарных мембранах, сформировавшихся вследствие воздействия излучения, недостаточен для выхода столь крупных молекул (молекулярная масса гемоглобина – около 68000 у.е.). Далее в эритроциты входит вода (для воды мембраны всегда легко проницаемы), объем клеток быстро нарастает и происходит разрыв эритроцитарной мембраны с выходом гемоглобина в среду инкубации. Описанный феномен носит название фотоиндуцированного гемолиза.

Следует заметить, что собственно гемолизу у облученных эритроцитов предшествует фаза набухания клеток. В норме в солевой среде (0,9% раствор NaCl) эритроциты имеют форму двояковогнутого диска и носят название дискоцитов. Набухание же клеток приводит к тому, что эритроциты приобретают сферическую форму – становятся сфероцитами. Переход дискоцит®сфероцит сопровождается увеличением объема клетки в 1,8 раза (интересно, что площадь эритроцитарной мембраны при этом не изменяется). Для того, чтобы гемолиз по рассматриваемому механизму, таким образом, все-таки произошел, необходимо, чтобы количество воды вне эритроцитов было достаточным для увеличения объема клеток выше указанного предела. Иными словами, данный тип гемолиза осуществим при относительно небольшой концентрации эритроцитов. Из-за этого в цельной крови, при гематокрите порядка 45-50%, фотоиндуцированный коллоидно-осмотический гемолиз не наблюдается. Однако полученные клетками повреждения все равно имеются, и при перемещении эритроцитов из облученной в достаточной дозе УФ излучением цельной крови в солевую среду (гематокрит не должен при этом превышать 0,5%) начинается их гемолиз.

Нужно заметить, что фотоиндуцированный коллоидно-осмотический гемолиз – процесс медленный. Поэтому обычно он наблюдается уже после прекращения действия излучения на эритроцитарную суспензию. Время между периодом облучения эритроцитов и началом их гемолиза может составлять, в зависимости от дозы облучения, от нескольких минут до нескольких часов (иногда – и суток). Поскольку эритроцитарные клетки неоднороды (различаются по возрасту и другим характеристикам) время латентного периода между облучением и гемолизом для каждого эритроцита индивидуально. Поэтому кинетика фотоиндуцированного гемолиза имеет сигмоидный вид (рис. 31). Соответственно, для описания характера фотогемолиза в конкретной эритроцитарной суспензии применяется величина времени, за которое гемолизирует 50% эритроцитов образца (величина t₅₀). Параметр же, обратный t₅₀, принято обозначать, как скорость гемолиза ( V_г ).

Фотоиндуцированный гемолиз носит завершённый характер – в образце гемолизируют все имеющиеся там эритроциты. Важно заметить, что пороговая доза УФ излучения (т.е. такая доза воздействия, ниже которой излучение эффекта не выявляется) в случае фотоиндуцированного гемолиза отсутствует. На начальных участках дозовых кривых скорость фотогемолиза пропорциональна второй степени дозы облучения. При этом данный фотоэффект почти не зависит от наличия в среде кислорода.

Рисунок 31. Типичная кинетика фотоиндуцированного гемолиза в физиологическом растворе (0,9% NaCl). Обратите внимание на то, что введение в образец сахарозы до конечной концентрации 5 мМ приводит к торможению гемолиза. Это связано с тем, что дефекты в эритроцитарных мембранах, сформировавшиеся под действием УФ излучения, пропускают катионы, но недостаточно велики для того, чтобы пропускать молекулы сахара. Находясь во внеклеточной среде, сахароза увеличивает ее осмотическую силу и уравновешивает онкотическое давление внутриэритроцитарного гемоглобина. Если бы сахароза не добавлялась, гемолиз развивался бы по кинетике, показанной пунктирной линией.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 139.

Математически зависимость скорости фотоиндуцированного гемолиза от дозы облучения при небольших значениях последней можно представить в следующем виде:

(142)

В этом выражении V₀ – скорость спонтанного (темнового) гемолиза, k – коэффициент пропорциональности, величина которого зависит от длины волны облучения, Е – доза облучения.

Зависимость (142) справедлива в тех случаях, когда продолжительность облучения клеток пренебрежимо мала в сравнении со временем гемолиза. Из нее вытекает, что в указанных условиях для появления одного катионного канала в эритроцитарной мембране требуется поглощение 2-х квантов ультрафиолетового излучения. Предполагается, что молекулой-акцептором этих квантов является так называемый белок полосы III эритроцитарных мембран, состоящий из 2-х субъединиц.

Известно, что данный протеин в норме выполняет функцию анионного канала. Каждый эритроцит имеет тысячи таких молекул в своей мембране. Фотохимическая модификация приводит к тому, что белок полосы III из анионного канала становится катионным. Но для этого модификации под действием излучения должны подвергнуться обе его субъединицы. Из этой особенности и вытекает квадратичный характер зависимости (142).

Спектр действия фотогемолиза при небольших дозах облучения оказался близок к спектру поглощения белковых молекул.

С увеличением дозы облучения эритроцитов, однако, характер зависимости V_г от дозы воздействия меняется: она из квадратичной становится линейной. Кроме того, появляется зависимость скорости фотогемолиза от наличия кислорода в среде: при облучении клеток в вакууме фотогемолиз существенно ослабляется (рис. 32). Иными словами, появляется кислородный эффект.

Время облучения, минуты

Время облучения, минуты

Рисунок 32. Дозовые зависимости фотоповреждения ( l >239 нм) эритроцитов и накопления продуктов окисления липидов (малонового диальдегида) в этих клетках на воздухе и в вакууме.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 141.

Изменение вида дозовой зависимости фотоиндуцированного гемолиза при увеличении доз облучения объясняется двумя причинами. Во-первых, длительность гемолиза становится сопоставимой с продолжительностью процесса облучения, а, во-вторых, меняется фотохимическая причина повреждения эритроцитарных мембран: происходит значительное увеличение вклада в это повреждение процесса перекисного фотоокисления липидов мембранного бислоя. При таких дозах облучения (если оно проводится в присутствии кислорода) в эритроцитах накапливается достаточно много продуктов этого процесса (рис. 32). Важно заметить также, что и накопление продуктов фотоокисления липидов в эритроцитах, и выраженность их фотоиндуцированного гемолиза ослабляются, если облучение клеток проводится в отсутствие кислорода (рис. 32) или в присутствии липидных антиоксидантов.

Поскольку физиологически эритроциты являются переносчиками кислорода и часто вынуждены пребывать в средах с высокой концентрацией этого окислителя, в этих клетках существует мощная система защиты от окислительного повреждения. Эта система при небольших дозах УФ облучения предупреждает значимое окисление мембранных липидов – наблюдается преимущественно фотомодификация мембранных белков, носящая неокислительный характер. Но, выполняя свою защитную функцию, эритроцитарная антиокислительная система постепенно истощается. В частности, из-за прямого фотолиза и расходования в свободнорадикальных процессах уменьшается количество основного липидного антиоксиданта, a -токоферола, в эритроцитарных мембранах. Ослабление же антиокислительной системы приводит к тому, что при больших дозах УФ облучения вклад перекисного фотоокисления липидов в повреждение мембран эритроцитов существенно возрастает.

Примером, доказывающим значимость систем антиокислительной защиты в фотоповреждении мембран, могут служить митохондрии. В норме эти органеллы находятся внутри клеток, где концентрация кислорода относительно невелика. Поэтому мембраны митохондрий не имеют столь мощной системы защиты от окислительного повреждения, как мембраны эритроцитов. Как следствие, дозовые зависимости фотоповреждения митохондрий (выражающегося в разобщении процессов дыхания и фосфорилирования) носят совсем иной характер. Уже при небольших дозах УФ облучения наблюдается существенное угнетение фотоповреждения митохондрий при облучении в отсутствие кислорода (рис. 33).

Рисунок 33. Нарушение ионной проницаемости мембран митохондрий при УФ облучении. Для выявления нарушения ионной проницаемости митохондриальных мембран применен метод импульсного закисления среды (метод рН-импульса). Введение в среду инкубации нативных митохондрий небольшого количества соляной кислоты сопровождается быстрым ее закислением с последующим медленным защелачиванием. Если митоходрии в составе образца предварительно обрабатывались детергентом (тритоном Х-100), закисление среды было менее выраженным и составляло DрН_о. Значение DрН_о определяется общей буферной ёмкостью вне- и внутримитохондриального пространств, поэтому вскоре значение этого показателя стабилизируются. Различия в DрН в разных образцах митохондрий (-(DрН-DрН_о)) определяются различиями в скоростях входа протонов из среды внутрь митохондрий и, следовательно, зависят от величины протонной проницаемости митохондриальных мембран данного образца. Важно заметить, что кинетика изменения -(DрН-DрН_о) носит экспоненциальный характер, что позволяет спрямить ее в полулогарифмических координатах. Тангенс угла наклона полученной прямой пропорционален скорости захвата протонов митохондриями исследуемого образца. С помощью описанного подхода было установлено, что УФ облучение митохондрий в присутствии кислорода сопровождается сильным увеличением протонной проницаемости их мембран. Протонная же проницаемость мембран митоходрий, подвергавшихся облучению без кислорода, почти не отличалась от таковой у нативных органелл.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 142.

Дата добавления: 2015-07-25