Задача 7. Охарактеризовать методы выделения чистой культуры анаэробов.

Для этого надо знать:

1. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом.

2. Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше).

3. Три этапа заключаются в следующем:

Первый день. Исследуемый материал (земля, гной) засевают для накопления в среду Китта-Тароцци.

Второй день: а) просматривают посевы, приготавливают мазки и окрашивают по Граму (в положительном случае обнаруживают помутнение среды и пузырьки газа в ней, а также в мазках – крупные споровые грамположительные палочки); б) для получения изолированных колоний делают посев материала из среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца.

Третий день: а) выросшие колонии изучают при помощи лупы и пересевают намеченную колонию в пробирку со средой Китта-Тароцци, которую помещают в термостат; б) проводят исследование чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным признакам.

4. Посев по методу Цейсслера производят следующим образом: каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци наносят на кровяной сахарный агар в первую чашку Петри и растирают шпателем по поверхности среды; затем этим же шпателем втирают материал в среду второй и третьей чашек для получения изолированных колоний. Посевы помещают в анаэростат или аппарат Аристовского. На следующий день по форме колоний (при рассматривании через лупу) и микроскопии мазков из них производят ориентировочное определение вида микроорганизмов и пересев отдельных, намеченных колоний на среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов.

5. Посев по методу Вейнберга производят следующим образом: одну или две капли (петли) материала из среды Китта-Тароцци вносят в пробирку с бульоном для разведения материала. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с предварительно прокипяченным (20 мин.) и остуженным до 50°С сахарным МПА, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до самого дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей водопроводной воды. При этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара.

Вместо узких пробирок могут быть использованы трубки Виньяля-Вейона. С их помощью можно произвести посев различных разведений почвенной взвеси для получения изолированных колоний. (Почвенную взвесь готовят следующим образом: к 1 г почвы прибавляют 100 мл стерильной воды в колбе на 250 мл, встряхивают на качалке 15 мин и отстаивают 5 мин; взвесь разбавляют в 10, 100 и 1000 раз, внося последовательно по 1 мл взвеси в пробирки с 9 мл стерильного 0,9 %-ного раствора NaCl.) В пробирки с 10 мл расплавленного и остуженного до 50°С сахарного МПА засевают по 0,1 мл полученных разведений почвенной болтушки (10³, 10⁴, 10⁵),быстро перемешивают и засасывают в стерильные трубки Виньяля-Вейона. Посевы помещают в термостат при 37° С.

6. Посев по методу Перетца производится следующим образом. Вначале готовят разведения исследуемого материала: запаянную пастеровскую пипетку погружают в исследуемый материал (почва, гной и т.д.) и переносят сначала в 3 пробирки с физиологическим раствором (5-10 мл), а затем последовательно в 3 пробирки с расплавленным и охлажденным до 45-50° С агаром по 18-20 мл в каждой. Внеся пипетку в среду, делают ею 1-2 вращательных движения, чтобы смыть посевной материал. Содержимое пробирок быстро перемешивают пастеровской пипеткой и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых кладут стерильные стекла или спички, покрытые стерильными квадратными стеклами (6х6 см). Образуется капиллярная полость, куда быстро затекает расплавленный агар, и где создаются анаэробные условия.

Вопросы и упражнения для самоподготовки.

1. Какие химические реакции протекают в бактериальной клетке?

2. Что такое ферменты?

3. Что представляют собой ферменты по химической природе?

4. Что такое специфичность действия фермента?

5. От чего зависит активность ферментов?

6. Как распределяются ферменты в бактериальной клетке?

7. На какие классы делятся ферменты по типу катализируемой реакции?

8. Какие ферменты называются оксидоредуктазами?

9. Какие ферменты называются трансферазами?

10. Какие ферменты называются гидролазами?

11. Какие ферменты называются изомеразами?

12. Какие ферменты называются лиазами?

13. Какие ферменты называются лигазами?

14. Что такое экзоферменты?

15. Что такое эндоферменты?

16. Какие функции выполняют экзоферменты?

17. Для чего служат ферменты агрессии?

18. Приведите примеры ферментов агрессии?

19. Почему ферменты агрессии являются фактором вирулентности патогенных бактерий?

20. Какой фермент агрессии способствует распространению микроорганизмов в тканях?

21. Какие ферменты бактерий называются конститутивными?

22. Какие ферменты бактерий называются индуцибельными?

23. Какие бактериальные ферменты используются в медицине?

24. Почему определение ферментного состава бактерий является важным для их идентификации?

25. Какие ферментативные свойства изучаются чаще всего для идентификации бактерий?

26. Какие ферментативные свойства изучаются дополнительно для идентификации бактерий?

27. Почему бактерии обладают различными биохимическими свойствами?

28. Назовите ферменты оксидоредуктазы, которые используются для идентификации бактерий?

29. Каким образом определяют наличие каталазы у бактерий?

30. Каким образом определяют наличие цитохромоксидазы у бактерий?

31. Что такое сахаролитические свойства?

32. Для чего изучают сахаролитические свойства бактерий?

33. Какие среды используются для изучения сахаролитических свойств бактерий?

34. Какие конечные продукты образуются при ферментации углеводов бактериями?

35. Опишите состав жидких сред Гисса.

36. Какой индикатор добавляется в жидкие среды Гисса?

37. Как и почему изменяется цвет индикатора в жидких средах Гисса?

38. Что наблюдается, если микроорганизм ферментирует углеводы в средах Гисса до образования кислоты?

39. Что наблюдается, если микроорганизм ферментирует углеводы в средах Гисса до образования кислоты и газа?

40. Какие сахара добавляют в среды Гисса при использовании короткого ряда?

41. Какие сахара добавляют в среды Гисса при использовании длинного ряда?

42. Опишите механизм работы сред Гисса.

43. Почему набор сред Гисса с углеводами получил название "пестрого ряда"?

44. Какой "пестрый ряд" характерен для E. coli?

45. Опишите состав полужидких сред Гисса.

46. Какой индикатор добавляют в полужидкие среды Гисса?

47. Как и почему изменяется цвет индикатора в полужидких средах Гисса?

48. Перечислите дифференциально-диагностические среды, в состав которых входит лактоза.

49. Опишите механизм работы среды Эндо.

50. Для идентификации каких микроорганизмов чаще всего используются среды Эндо, Левина, Плоскирева?

51. По какому признаку определяется ферментация лактозы на молочных средах?

52. Какая среда используется для изучения интенсивного кислотообразования?

53. Какой индикатор добавляется в среду Кларка, и как изменяется его цвет?

54. По какому признаку можно обнаружить наличие амилазы у бактерий?

55. Что такое протеолитические свойства?

56. Какие среды используют для изучения протеолитических свойств бактерий?

57. Какие конечные продукты образуются при расщеплении белков бактериями?

58. Какой фермент присутствует у бактерий, способных разжижать желатин?

59. Каким образом способность разжижать желатин используется для идентификации бактерий?

60. Как определяют образование индола при расщеплении белков бактериями?

61. Как определяют образование H₂S при расщеплении белков бактериями?

62. Как определяют образование аммиака при расщеплении белков бактериями?

63. Как выявляют способность бактерий расщеплять казеин?

64. Объясните суть методов выделения чистых культур бактерий.

65. Какие условия необходимо создать при выделении чистой культуры анаэробов?

66. В чем заключается работа 1-ого дня по выделению чистой культуры анаэробов?

67. В чем заключается работа 2-ого дня по выделению чистой культуры анаэробов?

68. В чем заключается работа 3-его дня по выделению чистой культуры анаэробов?

69. Какие методы посева используются для получения изолированных колоний анаэробов?

70. Как производится посев по методу Цейсслера?

71. Куда помещают чашки Петри после посева по методу Цейсслера?

72. Как производится посев по методу Вейнберга?

73. Как производят посев почвенной взвеси с использованием трубок Виньяля-Вейона?

74. Как производят посев по методу Перетца?

75. По каким свойствам проводят исследование и идентификацию чистой культуры анаэробов?

Дата добавления: 2015-07-25