Задача 11. Описать принципы выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов.

Для этого надо знать:

1. Выделение чистой культуры является основой бактериологической работы, т.к. в практической деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микробов (гной, испражнения и т.д.), идентификация же вида возможна только тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

2. Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основные группы методов выделения чистых культур: а) методы, основанные на механическом разделении; б) методы основанные на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

3. Чаще всего используются механические способы разъединения бактериальных клеток – специальные методы посева:

а) рассев шпателем по Дригальскому: берут три чашки Петри с питательным агаром; на первую чашку наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности агара; затем шпатель переносят во вторую чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды; аналогичным образом производят посев шпателем и в третьей чашке. На первой чашке вырастает максимальное количество колоний; на третьей – минимальное, где вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры;

б) рассев петлей ("штрихами" или "сеткой"): берут одну чашку Петри с питательным агаром; петлей на небольшом участке питательного агара делают сплошной посев исследуемого материала, а затем, отступив от засеянной площадки, делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

в) фильтрация: исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (в основном применяется для очистки вирусов от бактерий).

Т.о., при помощи специальных методов посева добиваются роста микроорганизмов на плотных питательных средах в виде изолированных колоний различных видов бактерий, содержащихся в исходном материале в виде смеси, т.е. получают чистую культуру из одной клетки, а далее осуществляют ее пересев.

4. Биологические способы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов:

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, подвижные формы микробов при размножении как бы "вползают" на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris), отсевая верхние края культуры в воду свежескошенного агара, и, повторяя это несколько раз, можно получить чистую культуру;

б) метод прогревания – прогревают материал при 80° С на водяной бане 10-15 минут, при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают (этот метод позволяет отделить споровые формы от неспоровых);

в) бактериостатический метод – при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на другие (например, пенициллин задерживает рост грамположительных микроорганизмов, не влияя на грамотрицательные; 5 % р-р H₂SO₄ убивает большинство микроорганизмов, а туберкулезная палочка выживает);

г) метод обогащения – посев на элективные питательные среды;

д) метод заражения лабораторных животных или растений – заражают исследуемым материалом восприимчивые к возбудителю виды животных или растений; после появления признаков заболевания производят посев органов и тканей на питательные среды (применяют для выделения патогенных видов микроорганизмов и отделения их от сапрофитов).

5. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2-3 суток (для выращивания микобактерий туберкулеза – 4-6 недель). Процесс выделения чистой культуры можно разделить на три этапа: а) отделение чистой культуры; б) накопление чистой культуры; в) идентификация – заключение о видовой принадлежности.

6. Первый этап (1-ый день):

а) из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют;

б) производят посев исследуемого материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37° С на 24-48 часов (на этом этапе можно использовать и какой-либо биологический способ).

Второй этап (2-ой день):

а) наблюдают результаты посева и проводят описание колоний разных видов по следующим признакам: размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция;

б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму для изучения морфологических и тинкториальных свойств; убеждаются в том, что колония содержит один вид бактерий;

в) осуществляют пересев одной или нескольких различных изолированных колоний в отдельные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37° С 24 часа.

Третий этап (3-ий день):

а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму (или другим методом) и микроскопируют; при наличии чистой культуры обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки (исключение – полиморфные организмы);

в) производят посев на жидкие и полужидкие среды Гисса и МПБ для изучения биохимических (сахаролитических и протеолитических) свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа;

г) проводят идентификацию выделенной чистой культуры по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и др. свойствам; делают окончательный вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры.

Морфологические признаки – форма, расположение и размеры бактериальных клеток.

Тинкториальные признаки – отношение к различным красителям. Эти признаки изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами (например, по Граму) и нативных препаратов.

Культуральные признаки – морфологические особенности колоний и характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Биохимические признаки – способность ферментировать белки, углеводы и другие соединения с образованием различных продуктов (определяются набором ферментов).

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если это является достаточным для их идентификации.

В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, восстановление нитратов, декарбоксилирование аминокислот, образование оксидазы, плазмокоагулазы, фибринолизина и других ферментов, а также определение антигенной структуры, чувствительности к фагам, вирулентности и т.д. Для этого проводят дополнительные исследования по определению соответствующего маркера (фермента, антигена, чувствительности к фагам).

Вопросы и упражнения для самоподготовки.

1. Чем отличается химический состав бактерий от других организмов?

2. Почему химический состав бактерий отличается изменчивостью?

3. Какие факторы влияют на химический состав бактерий?

4. Каково количественное содержание различных веществ в бактериальной клетке?

5. Какие функции выполняют белки в бактериальной клетке?

6. Какие функции выполняют ДНК и РНК в бактериальной клетке?

7. Какие функции выполняют углеводы в бактериальной клетке?

8. Какие функции выполняют липиды в бактериальной клетке?

9. Какие функции выполняют вода и минеральные соли в бактериальной клетке?

10. Чем объясняется разнообразие типов питания у бактерий?

11. Какие типы питания выделяют у бактерий по источнику углерода для синтеза органических соединений?

12. Какие бактерии называются автотрофами?

13. Какие бактерии называются гетеротрофами?

14. Какие типы питания выделяют у бактерий по источнику энергии для синтеза органических соединений?

15. Какие бактерии называются фототрофами?

16. Какие бактерии называются хемотрофами?

17. Какие типы питания выделяют у бактерий по донору Н₂ (е) для синтеза АТФ?

18. Какие бактерии называются литотрофами?

19. Какие бактерии называются органотрофами?

20. Какие типы питания выделяют у бактерий по источнику азота для синтеза органических соединений?

21. Какие бактерии называются аминоавтотрофами?

22. Какие бактерии называются аминогетеротрофами?

23. Какие бактерии называются фотоавтотрофами?

24. Какие бактерии называются хемоавтотрофами?

25. Какие химические реакции являются источником энергии у нитрифицирующих бактерий?

26. Какие химические реакции являются источником энергии у серобактерий?

27. Какие химические реакции являются источником энергии у железобактерий?

28. Какие бактерии называются хемо(органо)гетеротрофами?

29. Какие химические соединения используют для питания сапрофиты и паразиты?

30. Какие вещества называются факторами роста? Перечислите эти соединения.

31. Как называются бактерии, нуждающиеся в факторах роста?

32. Какие бактерии называются прототрофами?

33. Каким образом бактерии поглощают вещества из окружающей среды?

34. Какие вещества пропускает клеточная стенка бактерий?

35. Почему мембрана бактериальной клетки является основным регулятором поступления веществ в клетку и из клетки?

36. От чего зависит скорость поступления веществ в бактериальную клетку?

37. Перечислите механизмы транспорта веществ через цитоплазматическую мембрану?

38. Что такое простая диффузия?

39. Что такое облегченная диффузия?

40. Что такое активный транспорт?

41. Какой вид транспорта называется транслокацией химических групп?

42. Для чего используется культивирование бактерий?

43. Какие условия необходимы для культивирования бактерий?

44. На основе чего разрабатывается состав питательных сред?

45. Какие вещества должны содержать питательные среды?

46. Какими физико-химическими свойствами должны обладать питательные среды?

47. Почему питательные среды должны быть изотоничными?

48. Почему питательные среды должны быть стерильными?

49. Почему питательные среды должны обладать буферными свойствами?

50. Какая температура необходима для выращивания различных микроорганизмов?

51. Как делятся среды по составу?

52. Какие среды называются естественными?

53. Какие среды называются искусственными?

54. Какие среды называются синтетическими?

55. Как делятся среды по консистенции? Приведите примеры жидких сред.

56. Как делятся среды по консистенции? Приведите примеры полужидких и плотных сред.

57. Какие вещества используются для уплотнения питательных сред?

58. Какими свойствами обладает агар-агар, и для чего он используется?

59. Для чего используются простые питательные среды? Приведите примеры этих сред.

60. Для чего используются специальные питательные среды? Приведите примеры этих сред.

61. Для чего используются дифференциально-диагностические питательные среды? Приведите примеры этих сред.

62. Какое ферментативное свойство бактерий позволяют выявить среды Эндо, Плоскирева и Левина?

63. Почему колонии E. coli при выращивании на среде Эндо имеют красный цвет?

64. Назовите состав сред Эндо, Плоскирева и Левина.

65. Назовите состав жидких и полужидких сред Гисса.

66. Какие ферментативные свойства бактерий изучаются на средах Гисса?

67. Что такое чистая культура?

68. Почему выделение чистой культуры является основой бактериологической работы?

69. Какие существуют методы выделения чистой культуры?

70. На чем основаны биологические методы выделения чистой культуры?

71. На чем основаны механические методы выделения чистой культуры?

72. В чем заключается работа 1-ого дня по выделению чистой культуры аэробов?

73. В чем заключается работа 2-ого дня по выделению чистой культуры аэробов?

74. В чем заключается работа 3-его дня по выделению чистой культуры аэробов?

75. По каким признакам проводится идентификация чистой культуры?

Дата добавления: 2015-07-25