Тестирование праймеров к онкогенам E6/E7 папилломавирусов и человеческому гену-регулятору клеточного цикла р16.

Образцы нуклеиновых кислот. В работе использовались пробы кДНК, синтезированные на матрице РНК, выделенной из образцов тканей лиц, являющихся носителями вируса папилломы человека (ВПЧ) различных генотипов (таблица 10).

Таблица 10 - Проанализированные образцы кДНК

№	Диагноз	HPV-генотип (по гену E1/E2)
	CIN 1
	Вирусный цервицит
	Хр. Цервицит
	CIN 2. Беременность 36 нед.	31, 45

Праймеры. Тестировались две пары праймеров к гену р16 человека и одна пара праймеров к гену Е6/Е7 вируса папилломы человека (таблица 11).

Таблица 11 - Последовательности праймеров к генам Е6/Е7 ВПЧ и р16 человека

№ п/п	Название	Последовательность 5'→3'	Длина продукта кДНК, п.н.
1.	P16 F	CAGACATCCCCGATTGAAAG
2.	P16 R	TGAAAACTACGAAAGCGGG
3.	P16_2 F	CCCGCTTTCGTAGTTTTCAT
4.	P16_2 R	TTATTTGAGCTTTGGTTCTG
5.	Ep1	TGTCAAAAACCGTTGTGTC
6.	Ep2	GAGCTGTCGCTTAATTGCTC

ПЦР. Для постановки полимеразной цепной реакции в реальном времени использовался набор Maxima^TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Fermentas, # K0221). Реакция проводилась в объёме 20 мкл в стрипах Masterclear (Eppendorf, # 0030 132.890) по инструкции производителя набора. Праймеры добавлялись в диапазоне 0,05-0,5 µМ в зависимости от дизайна эксперимента. Постановка ПЦР осуществлялась на приборе Mastercycler epGradient S realplex 4. Состав 1 реакции ПЦР включал 10 мкл набора Maxima^TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix, 2 мкл кДНК, праймеры в конечной концентрации, предусмотренной дизайном эксперимента, и воду до объёма 20 мкл. Программа ПЦР состояла из: 95°С – 10 минут, 55 циклов по (95°С – 20 секунд, N°С – 20 секунд, 72°С – 30 секунд) и кривой плавления от 50°С до 95°С. Значения температуры отжига (N) и продолжительности стадии элонгации (72°С) зависели от дизайна конкретного эксперимента. Дополнительно отдельные образцы разгонялись электрофорезом в 2-процентном агарозном геле с добавлением бромистого этидия в конечной концентрации 0,1 мкг/мл.

Отработка ПЦР гена E6/E7 ВПЧ. Пара праймеров Ер1 и Ер2 тестировалась в диапазоне концентраций 0,3-0,5 µМ для каждого из праймеров и диапазоне температур отжига от 52°С до 60°С. Наименьшим значением Ст характеризовались образцы кДНК, амплифицируемые при концентрации праймеров 0,5 µМ в сравнении с образцами, которые амплифицировались при соответствующих температурах отжига, но с другой концентрацией праймеров. Из диапазона тестируемых температур оптимальной оказалась температура отжига, равная 54,5°С. Таким образом, значение Ст для образца кДНК, амплифицируемого при концентрации каждого из праймеров по 0,5 µМ и температуре отжига 54,5°С, составила Ст = 28,98. Специфичность праймеров подтвердалась единичным пиком на кривой плавления и агарозным электрофорезом (рис. 2а).

а) б)

1 2 1 2 3

Рис.7 (а) электрофоретический анализ продукта ПЦР гена Е6/Е7 ВПЧ: 1 – специфический продукт амплификации, 2 – маркер GeneRuler 50 из DNA ladder (Fermentas, # SM0371); (б) электрофоретический анализ продукта ПЦР гена р16: 1 – маркер GeneRuler 50 из DNA ladder, 2 – специфический продукт амплификации с температурой отжига 58°С, 3 - специфический продукт амплификации с температурой отжига 62°С

Отработка ПЦР гена p16 человека. Тестировались две пары праймеров: первая – P16_2F и P16_2R; вторая – P16_F и P16_R. Первая пара праймеров тестировалась в диапазоне концентраций от 0,3 µМ до 0,5 µМ каждого из праймеров и диапазоне температур отжига 55°С - 62°С. Было установлено, что увеличение флуоресценции в реакции обусловлено амплификацией димеров (конкатемеров) праймеров (данные не отображены). В случае применения температуры отжига, равной 60°С, была обнаружена незначительная амплификация специфического продукта кДНК наряду со значительной наработкой конкатемеров праймеров. Применение техники touchdown ПЦР с целью преамплификации специфической ДНК-мишени с температурой отжига 60°С не дало удовлетворительных результатов. Также не была успешной попытка снизить уровень неспецифичной амплификации снижением концентрации праймеров до 0,05 µМ. Данный результат может объясняться слишком длинным для ПЦР в реальном времени ампликоном (355 п.н.). В такой ситуации, при недостаточно хорошем дизайне праймеров, возможна преимущественная амплификация неспецифических продуктов по матрице самих праймеров в ущерб амплификации ДНК-мишени.

Для преодоления трудностей, связанных с длиной ампликона, была протестирована альтернативная пара праймеров, размер ампликона которых составляет 129 п.н. Праймеры тестировались в концентрации 0,5 µМ и при температурах 58°С и 60°С. Наименьшим значением Ст, как и предполагалось, характеризовалась реакция с температурой отжига 58°С. Значение Ст составило 29,16 против Ст = 34,21 в случае отжига на 62°С. В обоих вариантах постановки ПЦР не наблюдалось образования димеров праймеров (рис. 2б).

Таким образом, в результате тестирования оптимальными режимами ПЦР для генов Е6/Е7 ВПЧ и р16 человека были:

1. ген Е6/Е7: 95°С – 10 минут, 40 циклов (95°С – 30 с, 55°С – 30 с, 72°С – 30 с), кривая плавления от 50°С до 95°С. Праймеры: Ер1 и Ер2 в концентрации 0,5 µМ каждый.

Дата добавления: 2015-07-16