Использование ЯМР для изучения структуры белка.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) широко используется для изучения конформационных перестроек и динамики белков. Это связано с тем, что протоны (ядра водорода) наиболее распространены в биологических системах (содержание их в природных соединениях — 99,98%), и поэтому протонный ЯМР широко используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и мембран. Хорошо разработан также ³¹Р-ЯМР (содержание ³¹Р в природных соединениях фосфора - 100%). Содержание в природных соединениях углерода ¹³С очень мало (1,1%), но благодаря изотопному обогащению в последнее время изучается ¹³С-ЯМР.

Анализ спектров ЯМР белков затруднен вследствие большого количества атомов водорода. Наложение магнитных линий создает уширенные полосы в спектре ЯМР белков. Большинство резонансных полос для алифатических групп аминокислотных остатков имеет δ между 1 и 4,5 м.д., а для ароматических боковых групп (гистидин, фенилаланин, триптофан, тирозин) - между 7 и 9 м.д. По этим характерным полосам изучают развертывание белков при действии различных факторов (температура, рН), взаимодействие субстратов с активным центром фермента (по изменению сигналов ЯМР гистидиновых и фенилаланиновых остатков, которые часто находятся в активном центре), конформационные перестройки белков и динамику белковой структуры.

5.2 ЯМР-томография.

Вода - основная часть биологических объектов, поэтому основным сигналом тканей есть сигнал протонного магнитного резонанса молекул воды. Поскольку частота ЯМР пропорциональна напряженности внешнего магнитного поля, то, создавая в ткани градиент магнитного поля, можно получить спектр ЯМР, в котором интенсивность сигнала на данной частоте будет характеризовать относительное количество воды в той части ткани, которая находится в области определенного значения магнитного поля. Биологический объект «просматривают» в разных направлениях в магнитном поле. Затем с помощью компьютерного анализа воссоздают изображения по полученным проекциям. ЯМР-томография обеспечивает возможность изучения различных частей биологического объекта на основе различий амплитуды сигнала ЯМР в разных частях образца. Таким методом определяются размер и положение опухолей в организме. Поскольку намагниченность (время продольной релаксации Т₁) больше у опухолевых, чем у нормальных тканей, сигнал ЯМР воды опухоли насыщается более легко, чем сигнал нормальной ткани. Этот метод имеет преимущество перед рентгенографией, так как радиочастотное электромагнитное облучение не вызывает повреждений биологического объекта. Этим методом легко получают изображение органов внутри грудной клетки или области в полостях черепа без хирургического вмешательства.

ВОПРОСЫ И ЗАДАНИЯ К ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЕ

1. Какова природа явления ЭПР? Какие вещества и химические соединения могут быть исследованы при помощи метода ЭПР?

2. Назовите необходимое физическое условие возникновения ЭПР.

3. Чем обусловлено появление энергетических уровней при помещении исследуемого образца в постоянное магнитное поле, сколько их и почему?

Каков характер распределения электронов по энергетическим уровням и

чем он определяется?

4. Чем могут быть вызваны переходы между двумя энергетическими уровнями, при каком условии индуцируются переходы между указанными энергетическими уровнями, что происходит в результате такого энергетического перехода и какова его энергия? За счет чего возникает индуцированная эмиссия и чем определяется интенсивность наблюдаемого сигнала?

5. Какие способы наблюдение спектра ЭПР возможны и почему; какой из них используется на практике в ЭПР-спектрометрах?

6. Перечислите основными параметры сигнала ЭПР. Какой из перечисленных

параметров используется для идентификации парамагнитных центров?

7. Как определяется значения g-фактор? Каковы его значения для большинства парамагнитных центров, в том числе в митохондриях различных органов (и чем он обусловлен)?

8. Каким способом исключаются ошибки при оценке абсолютного количества спинов в образце? Какова чувствительность ЭПР-спектрометров?

9. Как и в каких единицах измеряется ширина линии ЭПР, от чего она и какую позволяет получить информацию? Почему сигналы ЭПР большинства парамагнитных комплексов в биологических объектах регистрируются при температуре жидкого азота и ниже?

10. Чем определяется форма линий спектра ЭПР? При каком условии в спектре ЭПР возможно наблюдение сверхтонкой структуры спектра и в результате чего она возникает?

11. Какие параметры сверхтонкой структуры позволяют сделать вывод о деталях строения молекулы и о распределении плотности неспаренного электрона между различными атомами, об электронной структуре атома с данным магнитным ядром, а также о взаимодействии парамагнитной частицы с окружающей средой и почему?

12. Какую информацию позволяет получить исследование сверхтонкой структуры спектров ЭПР?

13. Перечислите основные элементы. Каковаих максимальная чувствительность? В каком диапазоне частот работают ЭПР-спектрометры и почему; какое устройство используется для генерации?

14. На какие частоты настроены резонаторы ЭПР-спектрометров и почему; какова добротность резонаторов?

15. Почему в ЭПР-спектрометрах исполюзуются магниты значительных размеров?

16. Как меняются показания детектора в момент наступления резонанса?

17. Какова роль эффекта насыщения при исследовании в биологических образцах и как судят о наступлении насыщение?

18. Что называют спиновыми метками и спиновыми зондами? Какие из них получили наиболее широкое применение для биологических исследований? Какую информацию дает интерпретация интенсивности, ширины и формы линий спектра ЭПР спиновой метки и спинового зонда,введенных в биологическую структуру?

19. Какие данные получены благодаря применению спиновых меток и зондов?

20. Какова природа явления ЯМР? Какие вещества и химические соединения могут быть исследованы при помощи метода ЯМР и почему?

21. Назовите необходимое физическое условие возникновения ЯМР.

22. С чем связано широкое использование ЯМР для исследования

биологических систем?

23. Каков характер распределения ориентаций ядерных (протонных) спинов в отсутствии магнитного поля и почему?

24. Чем обусловлено появление энергетических уровней при помещении исследуемого образца в постоянное магнитное поле, сколько их и почему?

25. Каков характер распределения протонов по энергетическим уровням

и чем он определяется?

26. За счет чего создается намагниченность вещества и возникает

поглощение ЯМР? Почему интенсивность поглощения мала и каков

её порядок?

27. Чем могут быть вызваны переходы между двумя энергетическими уровнями, при каком условии индуцируются переходы между указанными энергетическими уровнями, что происходит в результате такого энергетического перехода и какова его энергия?

28. Какова частота налагаемого переменного электромагнитного поля и как она меняется с ростом внешенго магнитного поля?

29. Что происходит в результате поглощения переменного ЭМ-поля?

30. Перечислите основные блоки (элементы конструкции) ЯМР-спектрометра и опишите их назначение (кратко)?

31. Какие параметры измеряют с помощью ЯМР-спектроскопии?

32. Каков механизм спин-решеточной и спин-спиновой релаксации?

33. Какой тип релаксации определяет полуширину линий ЯМР?

34. Какое соотношение между временами спин-решеточной релаксации в твердых телах и жидкостях и почему?

35. Какова природа эффекта экранирования?

36. Какую информацию позволяет получить измерения химических сдвигов? Как измеряются химические сдвиги?

37. Как рассчитывается константа спин-спинового взаимодействия?

38. Опишите как с помощью метода ЯМР-томографии можно изучать различные части биологического объекта? В чем преимущества этого метода?

39. Почему для получения спектра ЯМР в ЯМР-томографии необходимо создавать в ткани градиент магнитного поля?

Дата добавления: 2015-07-19