Устройство спектрометра ЭПР

Современные спектрометры ЭПР конструируются с целью получения максимальной чувствительности, которая достигает 10¹⁰ спинов в образце. На рис.4 представлен общий вид ЭПР-спектрометра. Как и ЯМР-спектрометр, он включает электромагнит, источник СВЧ-излучения, электронную систему

регистрации. Но поскольку ядерный магнетон более чем на три порядка меньше магнетона Бора, то при данной напряженности магнитного поля Н резонансная частота ν для неспаренного электрона обычно в 10³ раз превышает частоту, на которой работают ЯМР-спектрометры. Если эксперименты по ЯМР проводятся на частотах в диапазоне мегагерц, то ЭПР-спектрометры работают в диапазоне гигагерц.

Конструктивно, все спектрометры содержат источник СВЧ, резонатор, в который помещается образец, детектор СВЧ волны и магнит (обычно резистивный). Серийные спектрометры собраны по так называемой мостовой схеме, обеспечивающей лучшую чувствительность, При этом измеряется мощность, отраженная от резонатора. Лабораторный спектрометр собран по проходной схеме, когда измеряется прошедшая через резонатор мощность ВЧ.

Устройство СВЧ тракта такого спектрометра показано на рис. 5. Источником СВЧ служит диод Ганна (1), расположенный в максимуме пучности электрического поля резонатора диода (2), Через отверстие связи (3) СВЧ волна проникает в резонатор с образцом (4). Образец располагается в максимуме пучности магнитного поля СВЧ HI (5), Отверстие связи (6) служит для вывода СВЧ в резонатор детектора (7), СВЧ колебания детектируются с помощью полупроводникового диода (8).

Частота генерации диода Ганна зависит от приложенного напряжения и равна - 9,8 ГГц, Для согласованной работы тракта все три резонатора СВЧ должны быть настроены на одну частоту - частоту генерации диода. Глубина связи между резонаторами регулируется при помощи настроечного винта (9), Постоянное магнитное поле создается электромагнитом (10), между полюсами которого установлены резонаторы.

Рис. 4. Исследовательский ЭПР – спектрометр РЭ – 1307 (СССР)

Ось магнитного поля Н направлена перпендикулярно плоскости чертежа величина рабочего магнитного поля в зазоре электромагнита должно быть однородным. Для получения такой однородности в большом объеме приходится увеличивать размеры полюсов до 25 см. Это, естественно, ведет и утяжелению всей конструкции. Так, серийные магниты весят около тонны. Для получения спектра ЭПР частоту электромагнитной волны фиксируют на частоте резонатора СВЧ, а магнитное поле Н медленно сканируют вблизи парамагнитного резонанса образца. В момент наступления резонанса, т.е. когда выполнено условие, электромагнитная волна поглощается образцом, и ток детектора падает. Добротность резрнатора обычно около 3 000, что, соответственно, првышает полезный сигнал в такое же число раз. Для улучшения чувствительности спектрометра используют метод синхронного детектирования: магнитное поле Н модулируют на частоте 30 кГц с помощью небольших дополнительных катушек (не показаны), а колебания тока через диод измеряют фазово-чувствительным вольтметром. При этом сигнал ЭПР записывается в виде первой производной. Метод синхронного детектирования не только улучшает отношение сигнал/шум, но и дает возможность получать спектры в более наглядном виде, так как из контура производной можно непосредственно измерять ширину линии. Сигнал ЭПР зависит от результирующего поглощения СВЧ-энергии, которое возникает благодаря существующей разнице в заселенности верхнего и нижнего энергетических состояний. Однако продолжительное подкачивание системы СВЧ-эиергией в условиях резонанса уравнивает заселенности энергетических уровней, приводя к уменьшению амплитуды сигнала ЭПР.

Рис.5. Устройство СВЧ-тракта спектрометра: 1- диод Ганна, 2 - СВЧ-резонатор диода, 3 - отверстие связи> 4 - проходной резонатор СВЧ, б - ампуле с образцом, 6 - отверстие связи 7 - резонатор детекторного диода, 8 - детекторный диод СВЧ, 9 - настроечный винт, 10 - полюс электромагнита

Процессы релаксации, которые устанавливают больцмановское распределение в условиях высокой мощности Р СВЧ-излучения, могут быть недостаточно быстрыми для его поддержания. Если интенсивность сигнала ЭПР перестает изменяться пропорционально P , наступает насыщение. Эффект насыщения следует учитывать при исследовании в биологических образцах парамагнитных металлоферментных центров и свободных радикалов семихинонного типа. С помошью насыщения представляется возможным разделить два перекрывающихся сигнала ЭПР при условии, что один из них не насыщается, а другой зависит от мощности СВЧ-излучения.

С помощью метода ЭПР показано, что биологические системы животного и растительного происхождения содержат свободные радикалы, которые представляют собой молекулу или ее компоненты, имеющие неспаренный электрон. Свободные радикалы обладают парамагнитными свойствами благодаря нескомпенсированным магнитным моментам неспаренных электронов.

Рис. 6. Схема ступенчатого восстановления убихинона до дигидроубихинона. При переносе электронов образуется свободно-радикальная форма – убисемихинон. В убихиноне из митохондрий млекопитающих гидрофобный хвост, который удерживает убихинон в мембране митохондрий, содержит 10 изопреноидных звеньев (конфермент Q₁₀)

Схема ступенчатого биологического восстановления или окисления с образованием промежуточной семихинонной формы, содержащей нечетное число электронов, является теоретической основой для объяснения образования свободно-радикальных состояний в окислительно-восстановительных реакциях (рис.6). Семихинонами принято называть различные органические промежуточные свободнорадикальные формы. Основным источником свободных радикалов в биологических системах являются семихинонные формы убихинона Q₁₀ и флавинов, структурные формулы которых представлены на рис.6 и 7.

Рис. 7. Флавосемихинон.

Метод ЭПР нашел эффективное применение для изучения молекулярных переносчиков электронтранспортной цепи мембран митохондрий, включающих НАДН, флавины, кофермент Q₁₀, железосерные центры, цитохромы b, c₁, с, а также цитохром c-оксидазу. В митохондриях различных органов при температуре 77 К регистрируется сигнал ЭПР с g-фактором 1,94, который обусловлен комплексами негемового железа в восстановленной форме. Применение температур ниже 30 К позволило идентифицировать при использовании метода ЭПР различные железо-серные (Fе—S) центры электронтранспортной цепи митохондрий.

В ряде органов при температуре 77К наблюдаются сигналы окисленной формы цитохрома Р-450 электронтранспортной цепи микросом. Сигналы ЭПР, обусловленные низкоспиновым состоянием гемового железа цитохрома Р-450 имеют g₁= 2,42, g₂ = 2,25 и g₃ = 1,91. Характерным свойством цитохрома Р-450 является возможность перехода низкоспиновой формы в высокоспиновую при его восстановлении, в этом случае регистрируется сигнал ЭПР со значениями g_┴ = 6,1 и g_║ = 2,0. Сигнал ЭПР цитохрома b₅ электронтранспортной цепи микросом при 20 К имеет три компонента с g₁= 3,05, g₂= 2,22, g₃ = 1,41.

Рис. 8. Стабильный нитроксильный свободный радикал – основа спиновых меток и зондов: R1 и R0 – химические группы
ЭПР-спектроскопия получила дальнейшее свое развитие вследствие применения спин-меток, т. е. синтезированных соединений, содержащих парамагнитный центр. Спиновыми метками обычно называют нитроксильные радикалы, которые ковалентно связываются с биологически активными молекулами.

Если связь радикала обусловлена электростатическими силами или гидрофобными взаимодействиями, то такая молекула называется спиновым зондом. Наиболее широкое применение для биологических исследований получили нитроксильные свободные радикалы, характеризующиеся стабильностью благодаря низкому уровню энергии основного состояния нитроксильной группы N^• — О, которая содержит неспаренные электроны (рис.8). Принципиальным свойством нитроксильных радикалов является способность к взаимодействию без затрагивания свободной валентности.

Спектр ЭПР нитроксильного радикала состоит из трех узких линий, эквивалентных по интенсивности и ширине, которые являются сверхтонкой структурой вследствие взаимодействия неспаренного электрона с ядром ¹⁴N. Константа сверхтонкого взаимодействия изменяется в пределах 15 – 17 Э в зависимости от природы растворителя и структуры остальной части молекулы спин-метки.

Интерпретация интенсивности, ширины и формы линий спектра ЭПР спиновой метки, введенной в биологическую структуру, дает информацию о физических и физико-химических параметрах микроокружения нитроксильного радикала. Уменьшение скорости молекулярного движения приводит к уширению триплетного спектра нитроксильного радикала, что свидетельствует об увеличении вязкости среды. Кроме определения времени вращательной корреляции τ, которое пропорционально микровязкости мембран, важнейшим является параметр упорядоченности S. Определение этого параметра позволяет судить о фазовых переходах в липидном слое мембраны и других средах. Так, параметр упорядоченности для липидов в жидком состоянии в несколько раз выше, чем в твердом. При снижении вязкости мембран параметр упорядоченности уменьшается.

Благодаря применению спиновых меток и зондов получены новые данные о строении и функционировании субклеточных структур, о липидах и белках, о липид-белковых взаимодействиях в мембранах. Применение спиновых меток, обладающих различной растворимостью в гидрофильной и гидрофобной фазах, открывает возможности для параллельного изучения структуры молекулярных комплексов мембран. Разработаны методы синтеза жирных кислот и фосфолипидов, меченных в определенном положении, что находит применение для характеристики подвижности фосфолипидов в бислое мембраны. Актуально применение метода ЭПР для изучения первичных и вторичных механизмов действия ионизирующей радиации на клетки и ткани.

Дата добавления: 2015-07-19