Криптокккоз

Возбудителем криптококкоза (европейского бластомикоза) яв­ляется Cryptococcum neoformans, поражающий преимущественно у лиц с иммунодефицитами (как правило, при СПИДе) ткань мозга, легкие, кожу, подкожную клет­чатку и слизистые оболочки. Наиболее часто криптококкоз протекает в виде хронического менингита с частыми ремиссиями и обострениями, иногда переходящего в энцефалит. При генерализации процесса прогноз обычно неблагоприятный. Заболевание встречается редко, но распространено повсеместно. Воз­будитель обитает в почве, в гнездах птиц, на растениях, в пищевых продуктах. Заражение происходит при вдыхании грибка с пылью.

Материалом для исследования при криптококкозе являются мокрота, гной, спинномозговая жидкость, кусочки ко­стей, биоптататов тканей из очагов поражения и секционный материал. Применяются следующие методы лабораторного исследования.

Микроскопический метод - исследование неокрашенных препаратов из материала от больного, в которых возбудитель выглядит в виде округлых или яйцевидных дрожжевых клеток размером 2х5, реже -10-20 мкм, покрытых толстой слизистой капсулой желтоватого цвета, иногда с одной длинной почкой (рис 33 а). Иногда толщина капсулы (до 50мкм) значитель­но превосходит размеры самой клетки гриба. Капсулу можно выявить также методом Гинса-Бурри. Реже исследуют гистологические препараты, окрашен­ные гематоксилином. Тканевая форма криптококка морфологически мало отличается от культуральной.

Микологический метод - посевисследуемого материала на среду Сабуро и другие среды для выращивания грибов. вы­ращивают при 25 — 30 °С. Через 1-5 суток выращивания при температуре 25-30⁰ С на среде Сабуро вырастают блестящие, слизисто-сальные, сметанообразной консистенции колонии беловатого, желтоватого или коричневого цвета с куполообразной гладкой поверхностью (рис. 33 б), реже — морщинистые или мелкозернистые. Идентификацию С. neoformans проводят по морфологическим, культуральным свойствам, способности расти при 37 °С, а также по биохимическим свойствам. Криптококки образовуют уреазу, фенолоксидазу, не растут в присутствии циклогексими­да, неспособны ферментировать углеводы.

А б

Рис. 33.Возбудитель криптококкоза (Cryptococcum neoformans) . а – в исследуемом материале, б – колонии на питательной среде.

Серологический метод -имеетвспомогательное значение, т.к. с помощью РА, РНГА, РП, РСК, РИФ антитела при криптококкозе обнару­живаются в невысоких титрах и непостоянно.

Биопроба - внутрибрюшинное или внутримозговое заражение мышей материалом от больных. Через 2-4 недели животных забивают с целью выделения чистой культуры гриба из внутренних органов. Выделенные культу­ры идентифицируют по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для диагностики криптококкоза.

Североамериканский бластомикоз (болезнь Джилкрайста—Стокса)

Возбудителем этого микоза является Blastomyces dermatitidis - диморфные грибы, вызывающие местное или системное хронически проте­кающее заболевание с гнойным поражением органов дыхания, кожи, подкожной клетчатки, костей, внутренних органов. Заболевание эндемично для США, Канады, встречается в странах Африки, реже - в Австралии, Индии, Латинской Америке, Европе. Возбудитель обитает в почве, заражение происходит при вдыхании спор гриба с пылью. Исследованию подвергают гной из свищей и абсцессов, спинномозговую жидкость, мокроту, мочу, пунктат лимфатических узлов и т.д.

Возбудитель североамериканского бластомикоза является диморфным грибом, который в тканях развивается в виде дрожжеподобных почкующихся клеток, а в культурах при 20⁰ С - в мицелиальной и дрожжевой формах.

Микроскопический метод – выявление в нативном препарате из материала от больного (или в гистологических препаратах, окрашенных по Романовскому—Гимзе) дрожжеподобных почкующихся округлых или овальных клеток, размером 8—15 мкм, с двойной обо­лочкой и единственной почкой, располагающейся на широком основании. Вместо образования почки клетка может вытягиваться и принимать вид языка колокола.

Микологический метод –посев насреду Сабуро, сахарный или сусло-агар с последующим выращиванием в течение 4-6 недель при температуре 20-25⁰ С в результате чего образуется мицелиальная форма гриба. Колонии гриба сначала круглые и гладкие, складчатые, дрожжеподобные, затем они последовательно покрываются белым, желтым и бурым пушком с короткими шипами. При микроскопии культур обнаруживают круглые почкующиеся дрожжевые клетки, большое количество септированных нитей мицелия с многочисленными боковыми конидиями круглой, овальной, иногда грушевидной формы, диаметром 3-5мкм. В старых культурах можно найти хламидоспоры, диаметром 7-18мкм.. Мицелиальная форма легко превращается в дрожжеподобную при выращивании при 37⁰ С, а дрожжевая при 20⁰ С в мицелиальную. На кислых средах вырастает мицелиальная, а на щелочных — дрожжевая форма гриба

Идентификация возбудителя североамериканского бластомикоза основывается на способности гриба трансформироваться в дрожжевую фор­му при температуре культивирования 37⁰ С и вырабатывать экзоантиген мицелиальной формы гриба, определяемый с помощью реакции иммунодиффузии с диагностической сывороткой и концентрированным экстрактом бульонной или агаровой культуры возбудителя. Для целей идентификации используются также методы генодиагностики.

Серологическое исследование. Для серодиагностики применя­ют РСК и реакцию иммунодиффузии.

Аллергологическое исследование -внутрикожные пробы с бластомицином – аллергеном, полученным из экстракта клеток возбудителя. Диагностическая ценность пробы невысока из-за перекрестных реакций.

Биопроба - заражение белых мышей с последующим посевом пора­женных тканей на питательные среды с целью выделения чистой культуры гриба и ее идентификации.

Генодиагностика - ПЦР для быстрого обнаружения ДНК возбудителя в исследуемом материале.

Южноамериканский бластомикоз (паракокцидиоидоз)

Встречается только в странах Юж­ной Америки, возбудителем является двухфазный гриб Paracoccidioides brasiliensis,поражающий кожу, слизи­стую оболочку полости рта и носовой части глотки, внутренние органы, лимфатические узлы. Возбудитель заболевания обитает на растениях и в почве. Зараже­ние происходит аэрогенным путем или при проникновении гриба через слизистую оболочку полости рта в результате ее травмировании при чистке зубов веточкой растения.

Микроскопический метод – изучение нативных или окрашенных по Граму, Романовскому—Гимзе и другими методами мазков из гноя, мокроты, отделяемого свищей, биоптатов и т.д. Клетки гриба круглые или эллипсоидные, крупные (от 30 до 60 мкм), окруженные толстой оболочкой. Материнская клетка окру­жена мелкими (2—10 мкм) дочерними бластоконидиями, приобретая характерный вид короны или корабельного штурвала. В отли­чие от возбудителя бластомикоза место соединения дочерних кле­ток с материнской узкое. Окончательный диагноз устанавливают после выделения и идентификации возбудителя.

Микологический метод. Гриб медленно растет на питательных средах, образуя через 3-4 недели культивирования при 37⁰ С белые или кремовые колонии, в мазках из которых обнаруживают дрожжевые клетки, раз­мером 40-50 мкм, окруженные большим числом бластоконидий на узком основании (вид «корабельного штурвала»). При более длитель­ном культивировании появляются признаки мицелиального рос­та. Идентификация гриба проводится с помощью реакции иммунодиффузии с использованием диагностической иммунной сыворотки для определения типа экстраги­руемого экзоантигена.

Дрожжевая форма возникает при выращивании культуры гриба при 37⁰ С, колонии в этой форме гладкие или складчатые, сходные с колониями дрожжеподобных грибов. В мазках из колоний видны овальные и круглые клетки крупного размера, с единичными или множественными почками или без них, напоминая тканевые формы гриба.

Мицелиальная форма возникает при выращивании культуры при температуре до 25⁰ С, характеризуется ростом складчатых колоний, покрытых в центре беловато-сероватым, а затем - желтоватым пушком. Под микроскопом видны ветвящийся мицелий и овальные конидии, диаметром 3,0-3,5мкм, которые располагаются по бокам мицелиальных клеток.

Для лабораторной диагностики южноамериканского бластомикоза (паракокцидиоидоза) применяют также методы серологической и аллергической диагностики, биопробу, ПЦР.

Гистоплазмоз

Возбудитель гистоплазмоза - диморфный гриб Histoplasma capsulatum вызывает широко распространенный природно-очаговый микоз в регионах с теплым климатом. В России гистоплазмоз встречается в виде спорадических случаев.

Совершенная стадия гриба является аскомицетом и имеет название Emmonsietla capsulata. Возбудитель гистоплазмоза может иметь дрожжевую (пара­зитарная форма, встречается в организме человека и животных или развивается на соответствующих искусственных средах), а также мицелиальную форму, свойственную природным и лабораторным штаммам. Дрожжевая форма в тканях и патологическом материале имеет вид одноядерных клеток округлой или грушевидной формы, размером 2-4мкм, с клеточной оболочкой, капсулой и почкой на более узком конце клетки и ядром, которое вдвое меньше клетки. Характерным для тканевой формы является расположение внутри макрофагов, гигантских клеток и клеток ретикулоэндотелиальной системы; реже клетки гриба лежат свободно и напоминают тканевые формы лейшманий.

Гистоплазма обитает в почве, загрязненной пометом птиц и летучих мышей, а также в гнездах птиц. Заражение происхо­дит аэрогенным путем при вдыхании пыли со спорами гриба. Для гистоплазмоза типичны острая или хроническая пневмония, поражение кожных покровов и слизистых оболочек, внутренних органов, развитие анемии, перитонита, менингоэнцефалита и т.д. Гистоплазмы поражают мононуклеарные фагоциты с формированием очагов казеозного некроза, последующим фиброзом и кальцинацией.

Материалом для иссле­дования является отделяемое язвенных поражений кожи и слизистой оболочки, мокрота, кровь, моча, спинномозговая жид­кость, пунктаты костного мозга, подкожной клетчатки. Применяются следующие методы лабораторной диагностики.

Микроскопический метод - исследование мазков из патологического материала или гистологических срезов поз­воляет выявить овальные дрожжеподобные одиночные или почкующие­ся клетки гриба, размером 10—15 мкм (рис. 34), а также микроконидии, размером 3-5 мкм. Результаты микроскопического исследования должны быть подтверждены выделением чистой культуры гриба.

Рис. 34. Возбудитель гистоплазмоза (Histoplasma capsulatum) в исследуемом материале.

Микологический метод. Исследуемый материал засевают на среду Сабуро, или другие питательные среды для грибов, посевы инкубируют при температуре 25-30⁰ С и 37⁰ С в течение 3-6 недель. Гистоплазмы образуют блестящие беловатые или коричневатые дрожжеподобные коло­нии мягкой консистенции, которые состоят из округлых клеток диаметром 4 — 5 мкм с мелкими почками на тонких ножках. При более низкой температуре инкубирования возбудитель образует белый волокнистый мицелий, образованный в зрелых колониях бугорчатыми макроконидиями и/или мелкими каплевидными ко­нидиями. Выделенную культуру идентифицируют по морфологическим и культуральным признакам, а также по антигенной структуре (реакция иммунодиффузии с диагностической сывороткой к антигенам гриба).

На среде Сабуро при температуре 25-30⁰ С характерен рост аэробной мицелиальной формы в виде пушистых колоний, цвет которых варьирует от белого до корич­невого. Мицелий в этих колониях септированный, ветвистый, многоядерный, диаметром до 5мкм. Макроконидии крупные, круглые или грушевидные, диаметром 10-25мкм, с шиловидными выростами, располагаются на концах воздушных нитей мицелия. Имеются хламидоспоры. Микроконидии гладкостенные, округлые, грушевидные или сигарообразные, размером 2-6мкм.

Дрожжевая форма гистоплазмы относится к факультативным анаэробам или микроаэрофилам и вырастает на кровяных средах с глюкозой при температуре 35-37⁰ С и рН 7,2-7,6. Колонии дрожжевой формы мелкие, блестящие, выпуклые, иногда складчатые, плотной консистенции, окрашенные в белый, серый, желтый, коричневый цвет. Клетки гриба овальной формы, размером 1,5-3,5мкм, размножаются только почкованием; почки образуются на одном или на двух полюсах, иногда аполярно. Может образовываться псевдомице­лий: почкующиеся дрожжеподобные клетки располагаются цепочками и нитями.

Серологический метод - постановка РИФ, РА, РИД и РСК с сывороткой крови больного гистоплазмозом и антигенами возбудителя гистоплазмоза (гистоплазмином, полученным из гифов гриба, или антигенами дрожжевой формы гриба) с целью определения антител к Histoplasma capsulatum.

Аллергический метод - постановка внутрикожной аллергической пробыс гистоплазмином. Методы им­мунодиагностики имеют второстепенное значение в связи с наличием перекре­стных реакций и позднего появления положительного результата.

Биопроба -внутрибрюшинное заражение исследуемым материалом белых мышей или золотистых хомячков. Через 1 мес после заражения животных умерщвляют и внутренние органы исследуют микологическим методом с целью выделения и идентификации чистой культуры гриба

Генодиагностика. Разработаны методы ПЦР-диагностики гистоплазмоза.

Кокцидиомикоз

Возбудителем эндемичного микоза - кокцидиоидоза является почвенный гриб Coccidioides immitis, который относится к диморфным грибам класса фикомицетов и встречается в тканевой, паразитарной форме в организме больных, а также в мицелиальной (весьма контагиозной форме) в почве и в чистых культурах на искусственных питательных средах. Заражение кокцидиоидозом происходит при вдыхании артроспор, находящихся в воздухе. Гриб вызывает тяжелые системные микозы у людей в виде гриппоподобного заболевания, кавернозного поражения легких, кожи, подкожной клетчатки, мозговых оболочек и других тканей организма.

Исследуемым ма­териалом являются гной, мокрота, кровь, спинномозговая жидкость, биопсийный (операционный) материал.

Микроскопический метод -исследование нативных и окрашенных (по Романовскому-Гимзе и т.д.) препаратов с целью выявления шаровидных образований (сферул), размером 20-60 мкм, с двухконтурной оболочкой, наполненных мелкими (2-4 мкм) округлыми эндо­спорами (рис. 35). Встречаются также разрушенные сферулы. В биопсийном материале обнаруживаются гранулемы, состоящие из полиморфноядерных лейкоцитов, лимфоцитов, эпителиоидных и гигантских клеток.

Рис. 35. Возбудитель кокцидиомикоза (Coccidioides immitis) в исследуемом материале.

Микологический метод – выделение чистой культуры Coccidioides immitis проводят в спе­циализированных лабораториях с соблюдением особых правил противоэпидемического режима безопасности. Посевы делают на среды Сабуро, МПА и МПБ с глюкозой. Через 1 неделю при температуре 37⁰ С С. immitis образует кожистые дрожжеподобные колонии, желтовато-коричневого цвета, врастающие в субстрат. При температуре 25⁰ С развивается мицелиальная форма гриба в виде пушистых, беловатых, на высоте спорообразования мучнистых колоний с характерными артроспорами. В некоторых колониях наблюдаются концентрические зоны пушистого мицелия. Мицелий септированный, артроконидии крупные толстостенные, размером 2-3x4-6 мкм, чередуются в гифах с тонкостенными клетками. В молодых культурах на плотных средах преобладает мицелий с интеркаларными хламидоспорами. Старые культуры богаты хламидоспорами, артроспорами, обрывками мицелия. При разрыве гифов артроспоры, обладающие высокой контагиозностью, освобождаются, легко переносятся током воздуха и при вдыхании людьми легко трансформируются в тканевые сферулы.

Кокцидиоидный гриб является аэробом, ферментирует моно-, ди- и полисахара, обладает выраженной протеолитической активностью (разжижает желатин и казеин, свернутую лошадиную сыворотку, пептонизирует и коагулирует молоко). Не восстанавливает нитраты в нитриты, не образует индола и сероводорода.

Для идентификации С. immitis применяют реакцию иммунодиффузии или прямую РИФ с сыворотками к антигенам кокцидий, а также методы генной идентификации.

Биопроба – заражение белых мышей, хомяков и самцов морских свинок (интратестикулярно или интраперитонеально), у которых единичные артро­конидии вызывают летальную инфекцию.

Серологический метод - постановка РП, РСК, РИФ, ИФА, позволяющих выявить спе­цифические антитела классов IgM и IgG в сыворотке крови больных кокцидиомикозом. При кокцидиоидном ме­нингите антитела можно обнаружить в ликворе боль­ных.

Аллергический метод – постановка кожных аллергических проб с кокцидиоидными аллергенами кокцидиоидином (аллергеном мицелиальной формы) и сферулином (аллергеном тканевой фор­мы). При положительной пробе через 24-48 часов отмечаются гиперемия, припухлость, папула в месте введения аллергена.

Лабораторная диагностика подкожных (субкутанных) микозов

Споротрихоз

Встречается почти во всех странах мира (чаще во Франции и США), возбудитель - Sporotrichumschenckii обладает диморфизмом, относится к нитчатым грибам, гифомицетам. Споротрихоз регистрируется преимущественно в странах с тропическим и субтро­пическим климатом, а в зонах с умеренным климатом - в теплое время года. Гриб обитает в почве, вегетирует на растениях.

Грибы проникают чаще всего в кожу конечностей при травме, реже - через слизистые оболочки дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта. Как правило, заболевают лица, работающие с растения­ми и древесиной. В месте поражения грибом развивается поражение в виде пустулы, абсцесса или язвы, лимфатические сосуды утолщаются и уплотняются. Заболевание характери­зуется поражением подкожной клетчатки и лимфатических узлов, образованием гумм в глотке, гортани, мышцах, синови­альных оболочках, костях, суставах, возникновением абсцессов в мышцах и внутренних органах, развитием пневмонии, пиелонеф­рита. Иногда может происходить диссеминация возбудителя с поражением внутренних органов и костей.

Материалом для исследования служат гной из свищей и язвен­ных поражений, соскобы с краев язв, пунктаты закрытых воспа­лительных очагов, биоптаты пораженных тканей.

Микроскопический метод. Тканевые формы в виде мелких грамположительных почкующихся клеток округлой или сигарообразной формы, напоминающих челнок, размерами 2—5мкм и покрытых слоем слизи, обнаруживают обычно внутри макрофагов. Однако эти находки в срезах тканей и в патологическом материале встречаются сравнительно редко. Иногда встречаются дрожжеподобные почкующиеся клетки, диаметром 2-8мкм, и так называемые «астроидные» тела — грибковые клетки, окруженные эозинофильными комплексами антиген-антитело.

При микроскопическом исследовании обнару­живают также септированный мицелий, размером 10-50 мкм, с харак­терными конидиями споротриксов в виде гроздей, напоминающих цветки мар­гаритки, а также не­большие (2-5 мкм), заостренные на концах, овоидные или сигароподобные конидии, расположен­ные попарно или в виде розеток на кон­цах мицелия.

Для экспресс-диагностики споротрихоза также применяется РИФ.

Микологическое исследование. Для выделения чистой культуры посевы про­изводят на плотные и жидкие питательные среды, которые инкубируют при температуре 25⁰ С или 37⁰ С.

В культурах споротрихум встречается в мицелиальной и дрожжевой формах.

Дрожжевые формы вырастают при температуре 37⁰ С на 4-6 день в виде гладких колоний желтого цвета, в которых при микроскопическом исследовании обнаруживают овальные и удлиненные толстостенные клетки, размером 1-2х4-8мкм; могут встречаться также круглые почкующиеся клетки, иногда связанные друг с другом длинной клеткой. Позднее колонии медленно увеличиваются в размерах, становятся серыми, складчатыми, редко сливаются.

Колонии гриба вырастают на 20 —25-е сутки. При бактериоскопии обнаружива­ют ветвистый, септированный мицелий шириной 2 — 6 мкм коричневого цвета и овальные споры, расположенные на стеригмах размером 2 — 5 мкм. При 37⁰ С споротрихумы ра­стут в дрожжевой форме — в виде еди­ничных овальных клеток.

Мицелиальная форма гриба растет при температуре 25⁰ С в течение 20-25 дней. Встречаются складчатые, крупнобугристые, многопетлистые, возвышающиеся колонии, окрашенные водонерастворимым пигментом сначала в кремовый, затем в желтый, коричневый и чер­ный цвет. Мицелий гриба ветвистый, септированный, диаметром 1,0-2,5х10-30 мкм. Конидии овальные, круглые, грушевидные или цилиндрические, часть из них имеют заостренные концы, размеры конидий 2-8х1,5-З,0 мкм мкм. Конидии располагаются обычно попарно одна против другой по бокам мицелия или группами по 5-10 спор на конце, иногда в виде розетки. Встречаются также коремии - анастомозирующие нити мицелия в виде тонких усиков или завитков с микроконидиями на воздушных концах. В старых культурах обнаруживаются хламидоспоры.

Биопроба – интратестикулярное заражение белых мышей. При микроскопии пораженных тканей отмечается трансформация мицелиальной формы гриба в дрожжевую. Мышей, крыс, морских свинок можно заражать также внутрикожно. Хоро­ший результат дают аллергические пробы со споротрихином.

Серологический метод - выявление антител в сыво­ротке крови больных к антигенам возбудителя споротрихоза с помощью РА, РСК и ИФА.

Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном гриба - споротрихином

Дата добавления: 2015-09-03