Микроматрицы и микрочипы ДНК

Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время становится использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе методов на небольшой по размеру поверхности стекла или другого твердого носителя иммобилизуют в виде правильно расположенных микропятен небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов (чаще всего синтетические олигонуклеотиды или кДНК), которые далее используют для гибридизации с анализируемыми образцами нуклеиновых кислот. При совпадении первичной структуры ДНК микропятна и анализируемого образца на поверхности стекла образуются правильные ДНК–ДНК-гибриды, которые обнаруживаются по появлению в данных участках микроматрицы сигналов, например в виде микроскопической флуоресцирующей точки или по тушению флуоресценции исходно меченых последовательностей. Такие кусочки твердого носителя с нанесенными на них микроматрицами ДНК получили название микрочипов ДНК.

Методы создания микроматриц ДНК

Рис. II.38. Комбинаторный синтез олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердой подложке

Последовательно предотвращая снятие защитных групп на определенных участках микроматриц (заливка серым цветом) удается соединять четыре нуклеотида во всех возможных комбинациях. В данном примере за 12 (4 х 3) стадий синтеза синтезированы все возможные (3⁴ = 81) тримеры олигонуклеотидов

Для нанесения нуклеиновых кислот на поверхность подложки в основном используют три подхода: короткие олигонуклеотиды синтезируют прямо на ее поверхности, а также прикрепляют к ней предварительно полученные фрагменты ДНК ковалентными или нековалентными связями.

Во время синтеза олигонуклеотидов непосредственно на поверхности стекла применяют те же реагенты и проходят те же стадии, что и при обычном твердофазном синтезе в современных автоматических синтезаторах. В наиболее распространенном варианте при создании микроматрицы используют фотолитографическую маску, которая избирательно закрывает от света и оставляет открытыми участки микроматрицы с синтезируемыми олигонуклеотидами, содержащими чувствительные к облучению светом защитные химические группы. На каждом этапе синтеза маску, которая на схеме обозначена серыми прямоугольниками, помещают над большей частью микроматрицы, а остающиеся открытыми химические группы активируют светом. Затем происходит соединение 5’-гидроксильных групп фосфорамидитных производных добавляемого нуклеотида с активированным сегментом микроматрицы.

Защищая поверхность микроматрицы от света дискретными участками в различных простых комбинациях, удается синтезировать, как это показано на схеме (рис. II.38), за 4·3 = 12 отдельных этапов все теоретически возможные последовательности тринуклеотидов в количестве 3⁴ = 81. В общем случае для синтеза всех возможных последовательностей длиной в N нуклеотидов требуется 4N синтетических стадии. Длина цепи олигонуклеотида, который может быть синтезирован на микроматрице, лимитируется выходом готового продукта на каждой стадии, который составляет ~95%. Так, суммарный выход 25-звенного олигонуклеотида будет составлять всего ~(0,95)²⁵ = 28%. В этой связи рассмотренный метод обычно используют для синтеза олигонуклеотидов, длина которых не превышает 20–25 оснований.

При альтернативном подходе микроматрицы олигонуклеотидов синтезируют на подложке с использованием технологии струйных принтеров. В этом случае головка принтера движется вдоль подложки и, в соответствии с заложенной программой, наносит на необходимые участки небольшие количества раствора с фосфорамидитными производными нуклеотидов из индивидуальных резервуаров. Этапы снятия защитных групп и промывания производятся так же, как и при обычном твердофазном синтезе олигонуклеотидов. Эффективность каждого этапа синтеза в этом случае может превышать 99%, что позволяет синтезировать олигонуклеотиды длиной до 40 оснований с суммарным выходом ~67% (40 этапов с выходом 99% на этап).

Еще одной разновидностью методов создания микроматриц является синтез индивидуальных олигонуклеотидов, их очистка и нанесение с помощью микроробота на поверхность подложки с адгезивным покрытием. Однако создание этим способом микроматриц, содержащих тысячи индивидуальных элементов, – очень трудоемкий процесс.

При конструировании микроматриц, элементы которых содержат индивидуальные кДНК, для нанесения на подложку микропятен чаще всего используют микророботы. В этом случае применяют растворы рекомбинантных кДНК длиной 0,5–1,0 т.п.о., очищенных из бактериальных клеток, которые перед применением как правило, амплифицируют с помощью ПЦР. Поверхность стеклянной подложки покрывают тонким слоем полилизина или обрабатывают аминосиланом с целью создания на ней положительного заряда, что обеспечивает возможность электростатического взаимодействия подложки с отрицательно заряженными молекулами кДНК. Недостатком этого способа является неспецифичность электростатических взаимодействий, в которые вовлечены многие участки кДНК, что уменьшает эффективность взаимодействия кДНК с последовательностями анализируемых образцов. Для преодоления этих затруднений с помощью асимметричной ПЦР синтезируют производные кДНК, которые далее ковалентно соединяют с сиалированным стеклом с помощью боргидрида.

Разрабатываются и альтернативные конфигурации микроматриц, в которых на поверхности стекла фиксируют сами фрагменты ДНК, анализируемой с помощью олигонуклеотидных зондов. Такой подход был использован, в частности для поиска мутаций в гене белка p53. Дальнейшим расширением этого подхода является нанесение на поверхность стекла кусочков тканей с последующим анализом содержащихся в них ДНК или РНК гибридизацией in situ.

Дата добавления: 2015-08-18