Природные антисмысловые РНК

За то время, которое прошло с момента открытия в середине 1970-х годов антисмысловых РНК и их успешного использования для искусственной регуляции экспрессии генов, стало ясно, что этот эффектный генно-инженерный прием уже давно и широко используется самой природой для тех же целей – модуляции экспрессии генов на молекулярном уровне. В прокариотических системах антисмысловые РНК участвуют в регуляции репликации и поддержании плазмид. Так, в случае плазмиды ColEI инициация ее репликации негативно регулируется с помощью короткой, нетранслируемой антисмысловой РНК. Антисмысловая РНК I плазмиды ColEI также играет ключевую роль в обеспечении несовместимости плазмид, принадлежащих к одной группе совместимости, внутри одной бактериальной клетки (подробнее см. раздел 4.2.2). Похожие механизмы с участием антисмысловых РНК используются и для регуляции репликации плазмид группы IncF1 (NR1, R1 и R6) и IncQ (R1162), а также для регулирования числа копий плазмиды pT181 Staphylococcus aureus. Антисмысловые РНК служат у бактерий для регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции (например гена белка-рецептора циклического АМР) и трансляции. В последнем случае антисмысловая РНК micF участвует в подавлении экспрессии белка OmpF внешней мембраны E. coli.

Экспрессия гена sulA E. coli, кодирующего SOS-индуцируемый ингибитор деления бактериальных клеток, регулируется нетранслируемой РНК, комплементарной на протяжении 250 нуклеотидов 3’-концевой части sulA -РНК. Регуляция на уровне трансляции антисмысловыми РНК имеет место у колицинового (E1) оперона плазмиды ColEI, а также оперона gvpABC цианобактерии Calotrix 7601, которые обеспечивают образование газовых везикул, придающих плавучесть бактериальным клеткам.

Антисмысловые РНК участвуют и в регуляции жизненного цикла бактериофагов. Например, у бактериофага l обнаружена короткая антисмысловая РНК, комплементарная мРНК гена Q и ингибирующая ее трансляцию. Это приводит к понижению уровня экспрессии поздних генов бактериофага и ингибированию его литического развития. Другой антисмысловой РНК фага l, участвующей в регуляции экспрессии гена сII-репрессора, является oopРНК. Эта РНК комплементарна 3’-концевой части транскрипта гена cII и после образования гибрида ингибирует ее трансляцию, вероятно, вследствие расщепления дуплекса РНКазой III клетки-хозяина. Небольшая антисмысловая РНК (sarРНК) участвует в регуляции синтеза антирепрессора фага P22. Та же система регуляции антисмысловых РНК характерна и для некоторых транспозонов. Антисмысловые РНК природного происхождения были обнаружены и в клетках эукариот. Так, наличие небольших ядерных поли(A^-)-РНК, комплементарных гену дигидрофолатредуктазы, характерно для ядер клеток мышей. Геномные локусы с генами, транскрибируемыми в двух противоположных направлениях, имеются у мышей, крыс и дрозофилы. Образование антисмысловых РНК отмечено во время латентной инфекции вирусом простого герпеса, а также в семенах ячменя. В последнем случае были идентифицированы антисмысловые РНК, комплементарные мРНК изозимов a-амилазы типов A и B.

Антисмысловые РНК, по-видимому, играют важную роль и в экспрессии ранних генов вируса полиомы. Геном вируса полиомы представляет собой небольшую кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, на которой транскрипция ранних и поздних генов происходит в противоположных направлениях с промоторов, расположенных в межгенной регуляторной области. Соответственно, в результате экспрессии ранних и поздних генов транскрибируются разные цепи ДНК. Терминация транскрипции поздних генов происходит неэффективно на поздних стадиях инфекции, что приводит к образованию в ядрах зараженных клеток гигантских РНК, заключающих в себе многократно повторяющуюся последовательность всего генома. При этом последовательности нуклеотидов таких РНК, соответствующие ранним генам вируса, являются антисмысловыми по отношению к нормальным ранним РНК вируса как продуктам транскрипции противоположной цепи вирусной ДНК. Накопление таких антисмысловых РНК приводит к резкому снижению внутриклеточного уровня ранних РНК, а экспериментальная дестабилизация антисмысловых РНК с помощью мутаций сопровождается значительным его повышением in vivo.

Приведенных примеров достаточно, чтобы сделать вывод о широком распространении антисмысловых РНК в природных условиях, хотя в случае эукариотических организмов физиологическое значение антисмысловых РНК непонятно. Расширение исследований в этой области молекулярной генетики несомненно приведет к открытию новых регуляторных механизмов с участием антисмысловых РНК. В том случае, если регуляторные функции антисмысловых РНК, реализуемые через РНК–РНК-гибриды, будут подтверждены у эукариот, это еще раз укажет на перспективность направления поисков путей искусственной регуляции экспрессии эукариотических генов с использованием антисмысловых РНК у животных и растений. Правильность такого направления уже сейчас подтверждается возможностью получения фенокопий у высших организмов с помощью антисмысловых РНК, а для повышения эффективности их действия необходимо просто оптимизировать условия их биосинтеза в эукариотических клетках. Использование техники антисмысловых РНК позволяет осуществлять высокоспецифическую инактивацию функционирования определенных генов in vivo и становится особенно полезным в тех случаях, когда инактивация соответствующих генов генетическими методами (с помощью мутаций) невозможна. Тем не менее значительная вариабельность в уровнях экспрессии антисмысловых РНК в клетках, содержащих эндогенные антисмысловые гены, а также некаталитический характер действия антисмысловых РНК, требующий их высокой внутриклеточной концентрации, накладывают серьезные ограничения на их применение. В этой связи перспективным направлением представляется использование рибозимов, фланкированных последовательностями антисмысловых РНК. Внутриклеточная стабильность таких макромолекул может быть существенно повышена путем конструирования антисмысловых РНК с оптимально подобранной пространственной структурой, а также использованием аналогов нуклеотидов для модификации этих макромолекул.

9.1.4. Антисмысловые РНК и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций

Вся совокупность полученных к настоящему времени данных позволяет предполагать, что антисмысловые РНК могут образовываться не только в результате реализации нормальных регуляторных механизмов, но и во время различных патологических состояний организма, выступая одной из причин их возникновения. Действительно, для того чтобы в клетке начали образовываться антисмысловые РНК, достаточно возникновения инверсии кодирующей части экспрессируемого гена, расположенной за промотором, направляющим транскрипцию этого гена. В таком случае может осуществляться инактивация самого гена, в котором произошла инверсия, и будет образовываться антисмысловая РНК, комплементарная нормальной мРНК мутировавшего гена. К аналогичным результатам будут приводить и транслокации кодирующих частей генов (с одновременной инверсией) под контроль промоторов других активно экспрессирующихся генов. По своей природе такого рода мутации, приводящие к образованию антисмысловой РНК, должны сопровождаться подавлением экспрессии аллельного гена, расположенного на гомологичной хромосоме, и даже целого семейства гомологичных генов. Следствием этого должно быть резкое снижение уровня и даже полное отсутствие в мутантной клетке белкового продукта мутантного гена с образованием фенокопий. К каким же последствиям для клетки могут приводить такие мутации?

В качестве одного из примеров, демонстрирующих потенциальную важность этих мутаций в развитии патологических состояний организма, рассмотрим возможные последствия инактивации с помощью вышеупомянутого механизма генов-супрессоров опухолевого роста, называемых также рецессивными онкогенами или антионкогенами. В настоящее время можно считать доказанным, что различные формы такого онкологического заболевания, как ретинобластома, возникают вследствие инактивации в единственной клетке-предшественнице обеих копий одного гена – RB1. В случае наследуемых форм ретинобластомы один мутантный аллель гена RB1 наследуется от одного из родителей больного, тогда как другой образуется в результате соматической мутации в малигнизирующейся клетке-предшественнице опухоли. При спорадической ретинобластоме инактивация обоих аллелей гена должна произойти в одной клетке, что является редким событием. Предлагаемая модель с участием антисмысловых РНК объясняет, каким образом инактивация обоих аллельных генов RB1 может происходить в результате одного мутационного события: инверсии части кодирующей последовательности гена RB1 или одновременной инверсии и транслокации части гена в новый хромосомный локус под контроль сильного промотора другого гена. В настоящее время у млекопитающих известны не менее 12 хромосомных локусов, утрата которых в результате делеций сопровождается малигнизацией клеток и которые содержат другие гены-супрессоры опухолей. Каждый из этих локусов потенциально может быть инактивирован с помощью эндогенных антисмысловых РНК. Следовательно, концепция антисмысловых РНК дает простое объяснение молекулярных механизмов одновременной инактивации аллельных рецессивных онкогенов в живом организме с последующей малигнизацией клеток и развитием опухолей.

Дата добавления: 2015-08-18