Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток

Выделение любого нового рекомбинантного гена описанными выше методами неизбежно заканчивается попытками получения его полноценной экспрессии в искусственных генетических системах. Только на первый взгляд экспрессия рекомбинантных генов в бактериальных клетках под контролем хорошо изученных регуляторных элементов бактерий представляется наиболее простой задачей. На практике, как уже обсуждалось ранее, экспрессия эукариотических генов в бактериях происходит крайне неэффективно из-за образования нерастворимых телец включения и отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей. Для преодоления этих затруднений в последнее время широко используются культивируемые клетки животных и растений, в геном которых рекомбинантные гены вводятся с помощью трансфекции.

Однако эффективный синтез рекомбинантных белков зависит не только от используемых клеточных линий. Основное влияние на этот процесс оказывают конструкция экспрессирующего вектора, а также сам метод введения рекомбинантных ДНК в эукариотические клетки. В последнем случае низкая эффективность доставки рекомбинантных молекул в клетки и неоптимальная локализация сайтов их интеграции в геном могут свести на нет все достоинства клеточных линий и экспрессирующих векторов. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантных генов, стабильно интегрированных в геном культивируемых клеток, разработаны методы их селективной амплификации. С использованием одного из таких подходов получены мутантные сублинии клеток яичников китайских хомячков CHO, в которых амплификация происходит в присутствии селектирующего агента, например метотрексата. Другие системы амплификации основаны на подавлении экспрессии жизненно важных ферментов, например глутаминсинтетазы или аденозиндезаминазы, под действием специфических ингибиторов: метионинсульфоксимина или 2’-дезоксикоформицина соответственно. Механизмы амплификации генов под действием ингибиторов ферментов будут подробнее рассмотрены ниже на примере метотрексата (см. раздел 7.4.1). Клеточные линии и клоны, стабильно продуцирующие рекомбинантные белки, как правило, получают путем отбора из пула гетерогенных клеток. И, наконец, еще одним существенным условием успешной экспрессии рекомбинантных генов является оптимизация самого процесса культивирования клеток, включая тщательный подбор культуральных сред.

Для получения рекомбинантных белков кроме вышеупомянутого метода стабильно трансфецированных линий клеток используют еще два современных подхода. С целью наработки небольшого количества рекомбинантных белков и контроля функциональной целостности генно-инженерных конструкций часто применяют временно экспрессирующиеся векторы, которые обладают способностью к репликации в культивируемых клетках COS во внехромосомном состоянии. В этом случае источником рекомбинантных белков являются супернатанты клеток. При другом подходе рекомбинантные белки синтезируют в культивируемых клетках насекомых после их заражения векторами на основе генома бакуловирусов. Последний подход становится все более популярным, так как допускает стабильную экспрессию многих рекомбинантных генов, продукты которых могут находиться как внутри клеток, так и в ассоциированном с поверхностью клеток состоянии, или они могут секретироваться в культуральную жидкость.

Недавно швейцарскими исследователями (С. Гайссе с соавт., 1996 г.) было проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии гена цитокина человека – фактора, ингибирующего лейкозы (leukemia inhibitory factor – huLIF) в разных эукариотических системах. Фактор huLIF представляет собой белок среднего размера, полипептидная цепь которого содержит несколько потенциальных сайтов N-гликозилирования и в процессе фолдинга образует три дисульфидные связи. Поскольку полученные результаты представляют большой практический интерес для генной инженерии и биотехнологии, так как иллюстрируют многие основные принципы функционирования рекомбинантных генов в гетерологичных системах экспрессии, они будут кратко рассмотрены ниже.

Дата добавления: 2015-08-18