Методические указания. Влияние внешних факторов на жизнедеятельность микроорганизмов

Влияние внешних факторов на жизнедеятельность микроорганизмов

Цель работы: изучить влияние некоторых физических, химических и биологических факторов на рост и развитие культур микроорганизмов; приобрести навыки посева и пересева микроорганизмов; освоить методы количественного учета микроорганизмов.

Методические указания

Жизнедеятельность микроорганизмов находится в непрерывной взаимосвязи с окружающей средой. Свойства окружающей среды могут подавлять развитие микробов, вызывать их гибель или способствовать высокой скорости их роста, размножения и биосинтеза целевых продуктов. Микроорганизмы в свою очередь способны вызывать изменения среды обитания, поглощая из нее различные вещества и выделяя продукты своей жизнедеятельности.

Факторы внешней среды многочисленны и разнообразны, обычно их условно разделяют на три группы - физические, химические и биологические.

К физическим факторам внешней среды, относят - влажность среды, осмотическое давление (создаваемое растворенными в среде веществами), температуру, различные формы лучистой энергии, гидростатическое давление.

К химическим факторам, оказывающим влияние на жизнедеятельность микроорганизмов, относят - состав и реакция среды (рН), окислительно-восстановительный потенциал среды, различные химические соединения.

К биологическим факторам, относят различные типы взаимоотношений между разными видами микроорганизмов, так и с иными организмами окружающей среда. Эта взаимоотношения могут носить симбиотический, антагонистический или паразитический характер.

Влияние того или иного фактора изучают путем выращивания микроорганизмов под воздействием или после воздействия исследуемого фактор. Результат влияния определяют по интенсивности роста микроорганизмов в питательных средах, а в ряде случаев по ферментативной активности в сравнении с контрольной культурой. Эффективность внешних воздействий на микробную клетку зависит от механизма и длительности действия фактора, видовой устойчивости микроорганизмов, интенсивности воздействия (дозы, концентрации), а также от физических и химических условий среды.

На практике интенсивность роста микроорганизмов часто выражают ориентировочными визуальными показателями: на жидких средах - степенью помутнения, на агаризованных - плотностью роста культуры. Более точная оценка достигается количественны методами: подсчетом числа клеток в единице объема среды (непосредственно под микроскопом или по количеству выросших колоний), а также определением общей биомассы культуры в единице объема среды. Биомассу микроорганизмов учитывают весовым способом (взвешивание сухой или сырой биомассы) и выражают ее в граммах или миллиграммах на литр среды. В ряде случаев используют химические способы (количественная оценка химических веществ клеток, например, общего или белкового азота). При исследовании бактериальных культур, развитие которых в жидких средах сопровождается равномерным помутнением среда, используют нефелометр (прибор, позволяющий определить биомассу культуры по интенсивности светорассеивания).

Количественные методы, используемые в микробиологии, позволяют установить

количество микроорганизмов в определенном объеме (или массе) исследуемого материала. Эти методы применяются при различных микробиологических анализах.

При исследовании продуктов степень микробной обсемененности характеризует их доброкачественность и эпидемиологическую безопасность; количественное содержание микроорганизмов является не менее важным показателем при санитарном контроле различных объектов внешней среды — воды, воздуха, производственного оборудования и т. д. Количественные методы учета применяются при исследовании интенсивности действия различных факторов на микроорганизмы, используются в производственных условиях для определения степени чистоты заквасок, товарных дрожжей и т. д.

Стандартные методы определения суммарного микробного обсеменения объектов могут быть разделены на 3 группы: 1) прямой подсчет клеток микроорганизмов; 2) количественный посев на плотные питательные среды (счет колоний); 3) титрационные посевы на жидкие питательные среды (определение минимальных объемов (или массы) материала, содержащих жизнеспособные микроорганизмы, т. е. определение титра микроорганизмов). Выбор метода зависит от характера изучаемых объектов и цели исследования.

Один из наиболее быстрых и достаточно точных методов определения общего количества микроорганизмов в суспензии - метод прямого подсчета клеток в камерах Горяева. Его можно использовать лишь для счета крупных объектов-клеток дрожжей, одноклеточных водорослей, спор грибов, некоторых бактерий.

Счетная камера Горяева (рис. 7.1) представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечно расположенные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. Боковые площадки на 0,1 мм выше центральной (глубина камеры) и служат для притирания покровного стекла. Сетка камеры Горяева разделена на большие квадраты. Площадь большого квадрата равна 1/25 мм², которые в свою очередь разделены на 16 малых квадратов, площадью — 1/400 мм². Объем камеры над малым квадпатом 4·10^-3 мм.

а	в
б
Рис.7.1. Счетная камера Горяева — Тома
а — вид сверху; б — вид сбоку (h — глубина камеры); в — деление камеры на квадраты.

Подсчет клеток ведут в 5 (можно в 10) больших или 20 малых квадратах по диагонали или по углам сетки и в центре. Перед подсчетом камеру и специальное покровное стекло хорошо промывают и просушивают. На поверхность сеток наносят по небольшой капле взвеси и накрывают покровным стеклом. Жидкость под стеклом должна растекаться по всей сетке равномерно, без пузырьков. Для соответствия расчетного объема камеры и объема суспензии покровное стекло притирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновых колец. Можно вначале притереть покровное стекло, затем с помощью пипетки заполнить камеру суспензией микроорганизмов. Подсчет клеток микроорганизмов производят через 3-5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и были, видны в одной плоскости. Камеру помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают сначала с объективом х8, а затем - х40. Учитывают все клетки, находящиеся внутри квадрата и на пограничных линиях, если они больше чем наполовину лежат внутри квадрата. Клетки, пересеченные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех сторон квадрата. Количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10, иначе исходную суспензию следует развести. Для этого пипеткой берут 1 мл исходной суспензии и переносят в пробирку с определенным объемом дистиллированной воды, тщательно перемешивают, и повторяют подсчет.

Для получения достоверного результата общее число учтенных микробных клеток должно быть не менее 600, поэтому из исходной или разведенной суспензии микроорганизмов следует брать 3-4 пробы.

Количество клеток в 1 мл суспензии рассчитывают по формуле:

(7.1.)

где а —сумма клеток, подсчитанная в 5 (или 10) больших или 20 малых квадратах сетки;

h — глубина камеры, h=0,l мм;

S — площадь малого квадрата, мм,

n - разведение суспензии.

Дата добавления: 2015-08-03