Подготовка материала для исследования в ТЭМ.

Приготовление сеточек. Прежде, чем приступить к резке, приготавливали сеточки, которые вместе с нанесенной на них пленкой-подложкой выполняют в электронном микроскопе функцию предметного стекла. Использовали в основном медные сеточки фабричного производства. На сеточки наносили пленку-подложку из формвара. Для изготовления такой пленки бралась стеклянная полоска. Это стекло протиралось спиртом, протиралось сухой тряпочкой и погружалось строго вертикально в сосуд с 0.15% раствором формвара в диоксане. Полоска быстро вынималась из раствора, промакивалась снизу фильтровальной бумагой и ставилась в эксикатор с небольшим количеством диоксана на 50 секунд, чтобы пленка высохла. После изъятия из эксикатора по краям пленки необходимо провести препаровальной иглой. Затем стекло с пленкой под небольшим углом осторожно погружалось в сосуд с дистиллированной водой. Пленка отделялась от стекла и оставалась плавать на воде. После этого на пленку пинцетом осторожно накладывали сеточки. Сверху сеточки накрывали кусочком кальки и когда к нему прилипали все сеточки, быстро вынимали кальку с сеточками из воды. После высушивания кальки, сеточки были готовы к употреблению.

Изготовление стеклянных ножей. Стеклянные ножи приготавливали перед резкой на специальном приборе “Knife-maker” из полос высококачественного шведского стекла. Перед приготовлением ножей стеклянные полосы тщательно мыли мылом с водой или спиртом и протирали насухо. Затем от полос отламывали квадраты, которые в свою очередь разламывали на треугольники, в результате чего получалось два ножа. К режущему концу ножа прикрепляли ванночки (пластмассовые или из фольги).

Во время резки в ванночки наливали дистиллированную воду или 10% раствор спирта и на эти жидкости при резке поступали срезы. Срезы в дальнейшем снимали на сеточки. При приготовлении ультратонких срезов, лезвие стеклянного ножа устанавливалось параллельно верхней грани пирамидки блока.

Резка. Концу блока, содержащему материал, придавали форму усеченной пирамиды. Заточку производили под стереомикроскопом МБС-1 бритвенным лезвием. Для устойчивости блок закрепляли в специальном держателе. Площадь верхнего сечения пирамиды составляла не более 0.2 мм². Ультратонкие срезы (толщиной 75 нм) и полутонкие срезы (толщиной 2 мкм) получали на ультрамикротоме Ultracut E (Reichert-Jung). Определение толщины срезов производили по их цвету. Наиболее хорошими ультратонкими срезами считали срезы золотистого цвета. Резку проводили стеклянными или алмазным ножами.

Полученные на микротоме срезы вылавливали на сеточки с пленками-подложками. Для этого сеточку брали специальным пинцетом с изогнутыми концами, и стороной, на которой находится пленка, накладывали на срезы. Срезы можно вылавливать и другим способом, при помощи стальной петли (Гайер, 1974), диаметр которой равен диаметру сеточки (3 мм). Серию срезов с каплей жидкости переносили петлей из ванночки ножа на сеточку с пленкой-подложкой, заранее отделенной от остальных сеточек и помещенной на кусочек фильтровальной бумаги. Когда петля соприкасалась с сеточкой, жидкость впитывалась в фильтровальную бумагу, а срезы оставались на сеточке.

Окрашивание (контрастирование) срезов. Для увеличения контраста срезы красили в растворе цитрата свинца, приготовленного по методике Рейнольдса (Reynolds, 1963). В чашку Петри насыпали несколько гранул NaOH (KOH), рядом с ними клали парафиновую пластинку примерно 10-12 см² и 0,5 см толщиной, на которую пипеткой наносили рядами капли контрастера. В 1 каплю помещали 1 сеточку со срезами, так чтобы срезы соприкасались с контрастером. Контрастирование срезов проводили в течение 5 минут при закрытой крышке. После окрашивания сеточки по очереди промывали струей дистиллированной воды. Затем края сеточки осушали фильтровальной бумагой так, чтобы бумага не касалась срезов. Посуду и инструменты после контрастирования отмывали раствором 1 N NaOH (KOH).

Приготовление цитрата свинца. Смешивали 1,33 г Pb(NO₃)₂, 1,76 г цитрата натрия, 15 мл кипяченой дистиллированной воды. Раствор энергично взбалтывали в течение 30 минут в мерной колбе на 50 мл. Затем в раствор молочно белого цвета равномерной консистенции добавляли 8 мл 1N NaOH (раствор просветляется). После просветления в мерную колбу доливали кипяченую дистиллированную воду до метки, закрывали притёртой стеклянной пробкой и дополнительно взбалтывали. Приготовленный раствор хранился в холодильнике.

Просмотр и фотографирование срезов проводили с помощью ТЭМ Tesla BS-500.

Дата добавления: 2015-07-20