Фиксация материала и пропитывание смолой для исследования с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЭМ)

Кусочки материала помещали в пробирки с раствором формальглутара и откачивали из них воздух с помощью насоса Комовского (для лучшего проникновения фиксатора) и колбы Бунзена при открытых пробках. Откачку воздуха прекращали, когда из материала практически переставали выделяться пузырьки и при открытой пробке у колбы Бунзена все кусочки материала в пробирках находились на дне и не всплывали. Пробирки с материалом, закрытые корковыми пробками, хранили в холодильнике не больше 20 дней. В 1-ый день проводки материал отмывали от формальглутара в течение 1 часа в трех сменах фосфатного буфера с pH 7.4 и проводили постфиксацию раствором 1-2% четырехокиси осмия. Раствор осмия наливали в пробирки так, чтобы материал был покрыт целиком. Пробирки с кусочками материала в растворе осмия ставили в холодильник на ночь. На второй день материал промывали фосфатным буфером с pH 7.4 2-3 раза и обезвоживали в серии ацетонов возрастающих концентраций. После обезвоживания начинали постепенно пропитывать материал эпоксидной смолой. На третий день материал извлекали из пробирок и раскладывали в ванночки с чистой смолой, затем ванночки с материалом оставляли в эксикаторе, на дне которого находились или пятиокись фосфора (P2O₅), или безводный хлорид кальция (CaCl₂), или силикагель. Через двое суток ванночки с материалом помещали в термостат, нагретый до 60 °С. Через 20-30 минут проверяли ориентацию кусочков материала в смоле, если было необходимо, то их ориентацию исправляли. Все работы необходимо проводить в вытяжном шкафу в резиновых перчатках!

Приготовление формальглутара (Karnovsky, 1965). 10 г порошка параформальдегида растворяли в 100 мл дистиллированной воды. После этого раствор грели на водяной бане и встряхивали. Когда раствор становится равномерно мутным, добавляли 1-2 капли (глазной пипеткой) 1 N NaOH. Получается 10% раствор параформальдегида (этот раствор можно хранить в холодильнике до 1 года). Затем смешивали 4 мл 10% параформальдегида, 2 мл 25% глутаральдегида (фабричная упаковка), 10 мл фосфатного буфера с pH 7,4 и 4 мл дистиллированной воды.

Приготовление фосфатного буфера состоит из двух этапов:

1. Приготовление маточных растворов.

Для приготовления 0,1 М раствора Na₂HPO₄ используется в следующей пропорции:

Объем раствора	Количество соли
1 л	35,81 г
0,25 л	8,95 г
0,05 л	1,79 г

Для приготовления 0,1 М раствора KH₂PO₄ используется в следующей пропорции:

Объем раствора	Количество соли
1 л	13,61 г
0,25 л	3,402 г
0,05 л	0,680 г

2. Приготовление фосфатного буфера. Для приготовления 100 мл буфера с рН 7,4 необходимо смешать 20 мл раствора KH₂PO₄ и 80 мл раствора Na₂HPO₄. Количество данного раствора определяется исходя из расчета около 1 мл на пробирку (данный раствор необходим для промывки от формальглутара и от раствора OsO₄). Для приготовления 10 мл буфера с рН 8 необходимо смешать 0,5 мл KH₂PO₄ и 9,5 мл Na₂HPO₄. Этот буфер используется для разбавления 4%-го маточного раствора OsO₄.

Фосфатный буфер как с рН 7,4, так и с рН 8 подлежит хранению, в подписанной посуде в холодильнике. При появлении в растворе белых хлопьев он считается непригодным.

Приготовление 2% раствора OsO₄ состоит из двух этапов:

1 этап. Приготовление 4% маточного раствора. Навеску OsO₄ растворяли в соответствующем количестве дистиллированной воды, чтобы получить 4% раствор. Ампулу с навеской обезжиривали 96° спиртом, свободный от OsO₄ конец слегка надпиливали надфилем, тщательно заворачивали в плотную бумагу и разбивали молотком под тягой. В бутылку из темного стекла с рассчитанным количеством воды высыпали весь OsO₄ с осколками ампулы, закрывали и оставляли на сутки. 4% маточный раствор хранится в морозильной камере в бутылке из темного стекла.

2 этап. Приготовление 1-2% OsO₄. Маточный 4% раствор OsO₄ разбавляется фосфатным буфером с рН 8 в соотношении 1: 1. В случае, если раствор 1-2% OsO₄ предполагается хранить, все операции необходимо проводить в посуде из темного стекла, в ней же оставлять на хранение. Препараты, содержащие OsO₄ крайне токсичны, поэтому все работы с этим веществом необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Ацетоны возрастающих концентраций. Готовили растворы ацетона следующих концентраций: 30%, 50%, 70%, 90% и 100% (абсолютный ацетон). Для этого в цилиндр наливали такое количество ацетона (марки хч), какую его концентрацию планировали получить, и доливали дистиллированную воду до метки 100 мл. (Для приготовления растворов ацетона различных концентраций пользовались не обезвоженным ацетоном).

Абсолютный ацетон готовили заранее (как минимум за сутки): в бутылку с ацетоном добавляли гранулы безводного хлорида кальция. Хлорид кальция высушивает ацетон, т.е. впитывает в себя воду, в результате чего получается абсолютный ацетон.

Обезвоживание материала ацетоном осуществляется в соответствии с таблицей:

Концентрация ацетона	Повторности
30%	3 раза по 15 мин
50%	1 раз, 15 мин
70%	1 раз, 15 мин
90%	1 раз, 15 мин
100%	2 раза по 30 мин

Пропитка материала смолой. Так как смола густая, ее вводили в материал постепенно. Приготавливали смеси смолы с абсолютным ацетоном следующих концентраций: 10%, 30% и 50% (или в случае труднопропитываемого материала 5%, 10%, 30%, 40%, 50%). Для этого в абсолютно сухой цилиндр последовательно наливали соответствующее количество приготовленной смолы, разбавляли ее абсолютным ацетоном и тщательно перемешивали стеклянной палочкой. Затем в пробирки с обезвоженным материалом последовательно заливали приготовленные смеси (смеси готовили непосредственно перед употреблением). В каждой смеси материал выдерживали 45 - 90 минут, в последней смеси (50% смолы) материал оставляли в пробирках, закрытых корковыми пробками, на ночь (под тягой, но не в холодильнике). На следующий день с утра пробки из пробирок вынимали и в таком состоянии оставляли пробирки на 2 часа для испарения ацетона (все операции со смолой производили только во включенном вытяжном шкафу и в резиновых перчатках). Через два часа кусочки из пробирок переносили в резиновые ванночки или ванночки, приготовленные из фольги, в которые залита чистая смола. Ванночки с материалом оставляли на 2 суток в эксикаторе при комнатной температуре. Через двое суток ванночки помещали в термостат для полимеризации смолы. Через 2-3 суток получили твердые блоки с заключенными в них кусочками материала, готовые для дальнейшей обработки.

Приготовление смолы (смесь эпона и аралдита) (Mollenhauer, 1964). Последовательно смешивали 3 части - Эпона 812, 5 частей - DDSA, 2 части - Аралдит М. Затем добавляли 2,5% ускорителя DMP-30 от общего количества смолы. Для получения смолы хорошего качества очень тщательно перемешивали смеси сухой стеклянной палочкой после каждого добавления очередного компонента. Также следили за тем, чтобы в смолу не попала вода, даже ее следы. Посуду заранее тщательно мыли и сушили.

Требуемый объем смолы необходимо вычислить. Для этого нужно суммировать:

· Количество смолы, используемой для пропитки материала (1);

· Количество смолы, необходимое при раскладке материала в ванночки – из расчета 1 кусочек материала в 1 ванночку, объем ванночки приблизительно 0,3 мл (2).

Промежуточные результаты вычислений желательно округлять в бóльшую сторону.

Сумму (1) и (2) принимали за 100% и вычисляли необходимое количество ускорителя.

Обработка посуды.

После работы со смолой стеклянную посуду тщательно промыть ацетоном, прокипятить в воде с мылом, после чего промыть водопроводной водой и ополоснуть дистиллированной водой.

Дата добавления: 2015-07-20