Супероксидрадикал и перекись водорода действуют как сигнальные молекулы

Как выяснилось, в клетках животных и растений О и Н₂О₂ в низких кон­центрациях могут действовать как сигнальные молекулы, влияющие на эксп­рессию генов. Показано, что в клетках животных они стимулируют накопление цАМФ и цГМФ, вход в клетку ионов Са²⁺, вызывают активацию протеинкиназ и т.д. Регуляторная роль этих молекул в жизни растений стала понятной при исследовании ответных реакций на действие стрессовых факторов. Давно было замечено, что некоторые стрессы сопровождаются у растений повыше­нием клеточного уровня О и Н₂О₂. В этом случае роль этих опасных молекул двойственная.

* Реакция сверхчувствительности связана с образованием некрозов и гибелью клеток расте­ния в месте внедрения патогена. Таким способом, т.е. ценой гибели собственных клеток, расте­нию удается избавиться от инфекции.

С одной стороны, они провоцируют окислительные реакции, способные привести клетку к гибели, с другой — выступают как участники сигнальных каскадов, в результате которых происходит экспрессия генов, кон­тролирующих синтез компонентов защитных систем. Выше (см. подразд. 4.2.10) было показано, что альтернативная оксидаза препятствует развитию окисли­тельного стресса и часто ее активность увеличивается в неблагоприятных для растения условиях. В эксперименте синтез АО de novo в растении можно стиму­лировать действием таких стимулов, как низкая температура, атака патогена, обработка салициловой кислотой и антимицином А. Во всех случаях наблюда­ется четкая корреляция между экспрессией гена Aoxl и накоплением перекиси. Так, в культурах клеток табака подавление цитохромного дыхания антимици­ном А сопровождалось интенсивным образованием О и накоплением перекиси. В этих условиях уже через 60 мин резко возрастало содержание мРНК Аох1, а через несколько часов увеличивались содержание и активность АО. Отсюда следует важный вывод: сигнал для синтеза АО de novo возникает в митохонд­риях и передается в ядро (рис. 4.29).

Рис. 4.29. Взаимодействие ядра и митохондрий в регуляции синтеза альтернативной

оксидазы.

АО кодируется ядерным геном Aox1, на экспрессию которого влияет уровень Н₂О₂ в клетке. Факторы, способствующие накоплению перекиси, стимулируют синтез АО

Как было показано на культурах клеток табака и петунии (Petunia sp.), транскрипцию гена Аох1 и синтез АО можно вызвать обработкой клеток экзогенной перекисью водорода или салициловой кислотой. Известно, что салициловая кислота связывает и блокирует каталазу, что, естественно, приводит к повышению внутриклеточного содержания пе­рекиси. На основании этих данных исследователи вполне справедливо пришли к выводу, что Н₂О₂ действует как сигнальная молекула, вторичный мессенджер в цепи сигнальной трансдукции, результатом которой являются экспрес­сия гена Aox1 и синтез АО.

Перекись является также звеном в цепи передачи сигнала, включающего экспрессию генов, кодирующих синтез ферментов аскорбат-глутатионового цикла. Например, добавлением перекиси можно инициировать синтез аскорбатпероксидазы в культурах клеток риса (Oruza sativa). Известно, что салици­ловая кислота, которая синтезируется в растении, обладает гормональной ак­тивностью и участвует в индукции ответных реакций растения на внедрение патогена. Оказалось, что в этом случае эффект объясняется способностью са­лициловой кислоты блокировать активность каталазы. Именно накопление пе­рекиси влияет на транскрипцию генов, контролирующих синтез PR (pathoge-nesis-related)-бeлкoв. Таким образом, при внедрении патогена появление в клетке Н₂О₂ является сигналом для экспрессии генов, включенных в системную ус­тойчивость.

Однако наиболее интригующей является роль АФК в апоптозе, т. е. генети­чески программируемой клеточной смерти. Апоптоз в клетках животных связан с деградацией белков, конденсацией хроматина и сопровождается характер­ными цитологическими изменениями. Специфические протеазы (caspases) и эндонуклеаза, которые в норме присутствовали в цитозоле в неактивной фор­ме, вовлекаются в апоптоз и участвуют в разрушении белков и фрагментации ДНК. Известно, что активация каспаз связана с их протеолитическим расщеп­лением. Долгое время считали, что митохондрии не вовлекаются в апоптоз, так как не подвергаются видимым изменениям. Однако оказалось, что именно митохондрии — главные участники активной программы клеточной смерти. Внутреннее пространство митохондрий содержит особые белки, которые при выходе в цитозоль вызывают активацию каспазы и эндонуклеазы, тем самым инициируя апоптоз. Прежде всего, это так называемый AIF-фактор (apoposis-induced factor) и цитохром с, локализованные в межмембранном пространстве. Однако что же заставляет эти соединения выходить из митохондрий и как они это делают? Еще до наступления видимых изменений, характерных для апоптоза, в митохондриях фиксируется повышенный уровень О . Супероксидрадикал, действуя прямо или косвенно, инициирует формирование специальных mtPTP-nop (permeability transition pore). Они представляют собой комплекс бел­ков, формирующий в месте контакта внутренней и наружной мембран широ­кий канал, или пору, через которую в цитозоль выходят AIF-фактор и цитох­ром с (рис. 4.30).

Рис. 4.30. Формирования mtPT-пор:

А — нормальное состояние митохондрий. Во внутренней мембране работает дыхательная цепь и синтезируется АТФ. Цитохром с нахо­дится в межмембранном пространстве и уча­ствует в работе дыхательной цепи. Обмен АТФ на АДФ осуществляется через АТФ/АДФ транс­локатор, локализованный во внутренней мемб­ране. AIF-фактор присутствует в матриксе. VDAC-канал формирует крупные поры в на­ружной мембране; Б — интенсивное образова­ние в дыхательной цепи супероксидрадикала на комплексах 1 и 3 провоцирует формирова­ние mtPT-пор в месте контакта внутренней и наружной мембраны. Поры формируются при участии АТФ/АДФ-транслокатора, VDAC-канала и белков матрикса и цитозоля. Выход в цитозоль через mtPT-поры цитохрома с и AIF-фактора необходим для инициации апоптоза в клет­ке. ANT — АТФ/АДФ-транслокатор; цит. с — цитохром с; VDAC — потенциалзависимый анионный канал; Вах — белок цитозоля, необ­ходимый для формирования mtPT-пор; х —

точно не установленные белки из цитозоля;

CD (циклофилин D) — белок матрикса, необходимый для формирования mtPT-пop; 1, 3, 4 —

комплексы цепи

В образовании mtPT-пop принимают участие белки, которые в норме выполняли в митохондриях другие функции. Точный состав mtPT-пop неизвестен, но есть основания думать, что в их состав входят:

• АТФ/АДФ-транслокатор — (ANT — adenylate translocator) в нормально функционирующих митохондриях этот транспортный белок интегрально встроен во внутреннюю мембрану и осуществляет обмен АТФ и АДФ;

• VDAC (voltage dependent anion channel)— потенциал-зависимый анион­ный канал внешней мембраны;

• циклофилин D(cyclophilin D) — белок, в норме присутствующий в мат­риксе митохондрий;

• неизвестные белки из цитозоля.

На формирование и открытие mtPT-пор оказывают влияние многие факто­ры, такие, как величина ∆ψна мембране, концентрация Са²⁺, уровень АТФ и АДФ в матриксе и цитозоле. Кроме того, косвенным образом состояние mtPT-пор зависит от эффективности антиоксидантных систем, нейтрализующих О . Открытие mtPT-пор приводит к цепи необратимых событий, заканчивающих­ся гибелью клетки. Выход из митоходрий в цитозоль AIF-фактора и цитохрома с сопровождается активацией специфической протеазы и запуском каскада протеолитических реакций, результатом которых является разрушение белков и деградация ДНК (рис. 4.31). Помимо этого, нарушение замкнутости внутрен­ней мембраны приводит к коллапсу ∆ ρ и энергетическому кризису, что также ускоряет гибель клетки.

Рис. 4.31. Инициация апоптоза

Выход из митохондрий в цитозоль факторов апоптоза запускает каскад событий, результатом которо­го является разрушение белков и ДНК. Из митохон­дрий через mtPT-поры выходят цитохром с и AIF-фактор (apoptosis-induced factor). В цитозоле цитохром с в комплексе с белком apaf 1 и АТФ активирует протеазы, специфически разрушающие белки. AIF-фактор активирует еще один белок — DFF (DNA-fragmentation factor) — фактор, необходимый для активации эндонуклеазы и фрагментации ДНК

У растений программируемая клеточная смерть (ПКС) является неотъем­лемой частью нормального роста и развития. Старение листьев и цветков, от­мирание клеток при формировании сосудов ксилемы и корневого чехлика, гибель клеток в реакции «сверхчувствительности» — примеры, когда смерть клеток является генетически детерминированной. Апоптоз растений сопровож­дается несколько иной, чем у животных, цитологической картиной, но мож­но предполагать, что сценарий этого процесса у тех и других включает общие элементы. Показано, что смерть клеток, формирующих сосуды ксилемы у цин­нии (Zinnia sp.), клеток табака, в реакции сверхчувствительности сопровожда­лась активацией специфических протеаз и эндонуклеаз, а также фрагментаци­ей ДНК. Сигнал, индуцирующий ПКС у растений, неизвестен. Однако им вполне вероятно являются О и Н₂О₂, накопление которых предшествует гибели кле­ток, например при старении листьев и цветков. При этом АФК, видимо, не только разрушают клеточные структуры как окислители. Есть данные, что при старении листьев Н₂О₂ вызывает экспрессию генов, включенных в процесс разрушения хлорофилла, однако вопрос о роли митохондрий в ПКС у расте­ний остается пока неизученным. Существуют лишь единичные и косвенные данные, подтверждающие, что апоптоз у растений также связан с событиями в митохондриях. Так, выход в цитозоль цитохрома с и фрагментация ДНК наблюдались при гибели клеток огурца (Cucumis sativd) в результате теплового шока. Трансгенные линии табака (AS8), лишенные альтернативной оксидазы, погибали при обработке экзогенной перекисью водорода. При этом наблюдали выход в цитозоль цитохрома с и фрагментацию ДНК. На примере клеток жи­вотных известно, что Са²⁺ на фоне низкого содержания АТФ способствует открытию mtPT-пop и развитию апоптоза. Аналогично этому на клетках куку­рузы было показано, что вход в клетку кальция при низком уровне АТФ может спровоцировать их смерть по типу апоптоза.

Дата добавления: 2015-07-15