|
Читайте также: |
Инсулин человека можно производить четырьмя способами:
1) полным химическим синтезом;
2) экстракцией из поджелудочных желез человека (оба этих способа не подходят из-за неэкономичности: недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья для массового производства вторым способом);
3) полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;
4) биосинтетическим способом по генноинженерной технологии. Два последних метода позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.
Препараты инсулина отличаются друг от друга по степени очистки; источнику получения (бычий, свиной, человеческий); веществам, добавляемым к раствору инсулина (удлиняющим его действие, бактериостатикам и т.д.); концентрации; величине рН; возможности смешивания ИКД с ИПД.
Препараты инсулина различаются по источнику получения. Инсулин свиньи и быка отличается от человеческого по аминокислотному составу: бычий - по трем аминокислотам, а свиной - по одной. Препараты рекомбинантного инсулина человека по химической структуре полностью идентичны человеческому инсулину.
Существует два основных подхода для получения генно-инженерного инсулина человека.
В первом случае осуществляют раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.
Во втором - получение в виде предшественника (проинсулина) с последующим ферментативным расщеплением трипсином и карбоксипептидазой В до активной формы гормона.
I способ. Схема получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli- Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):
1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.
2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).
3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации плазмид.
4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.
5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих А и В цепи.
6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.
7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.
II способ. Применяется штамм-продуцент E.coli, для создания которого была использована рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая рекомбинантный белок (РБ).
Технологический процесс производства инсулина (ИБХ РАН) основан на следующей схеме:
1. Получение посевного материала штамма-продуцента (оживление консервированной культуры; выращивание маточной культуры; выращивание инокулята).
2. Биосинтез рекомбинантного белка (РБ) (выращивание продуцента в ферментере (ферментация); получение биомассы (сепарирование); дезинтеграция клеточной суспензии; выделение и отмывка телец включения (центрифугирование)).
3. Выделение и очистка РБ (солюбилизация телец включения и восстановление РБ белка; ренатурация и последующая хроматографическая очистка РБ).
4. Ферментативное расщепление РБ.
5. Хроматографическая очистка инсулина.
6. Получение кристаллов инсулина.
Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.
Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.
Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.
Интерфероны
Интерфероны – группа белковых веществ, вырабатываемых клетками, зараженными вирусами. Интерфероны индуцируют противовирусные реакции
Виды интерферонов:
α-группа - лейкоцитарный интерферон
β-группа – интерфероны фибробластов
γ-группа - иммунный интерферон, Т-лимфоциты
Интерфероны обычно получают из донорской крови человека, хотя в настоящее время уже применяют генноинженерные способы получения интерферонов.
Рекомбинантные ИНФ синтезируются рекомбинантными микробными клетками – продуцентами (бактериями, дрожжами), полученными с использованием методов генной инженерии.
Интерфероны α и β проявляют противовирусное и противоопухолевое действие, γ-интерферон отличается выраженными иммуномодулирующими свойствами.
Процесс получения интерферона в основных чертах одинаков для всех типов клеток, выращиваемых в культуре и продуцирующих интерферон. Человеческие клетки в культуре заражают вирусом Сендай и через 24 часа центрифугируют. Из надосадочной жидкости получают грубый препарат интерферона, который подвергают очистке. Методу получения интерферона из лейкоцитов крови свойственны два недостатка. Во-первых нормальные, то есть не раковые лейкоциты не удается культивировать, в связи с чем массовое их производство затруднено и во-вторых, чистота конечного продукта неудовлетворительна, в результате чего получается смесь интерферонов. В настоящее время разработаны новые методы очистки интерферонов. Они заключаются в том, что после выделения грубая фракция интерферонов подвергается хроматографиической очистке на колонках. К наполнителю этих колонок химически присоединены моноклональные антитела, полученные против того класса интерферона, который планируется получить. В настоящее время мировая потребность в интерфероне полностью удовлетворяется фармацевтическими фирмами.
Фибробластный интерферон (β -интерферон) синтезируется фибробластами (клетками соединительной ткани). Фибробласты удается размножать в культуре вне организма, поэтому они пригодны для массового получения интерферона, что проще чем получать его из лейкоцитов. γ -интерферон, или имунный интерферон, синтезируется в Т-лимфоцитах человека. Его образование может стимулироваться рядом веществ, например белком А (энтеротоксином) стафилококков. В целом методы получения интерферонов все трех классов характеризуются низкими выходами, стоимость продукции велика, а чистота препаратов недостаточна. Поэтому очень большие надежды возлагались на способы получения интерферонов, основанные на методах рекомбинантных ДНК.
В качестве рекомбинантных продуцентов первоначально использовали клетки E.coli, накапливающие продукт внутриклеточно, что осложняет его выделение и очистку. Более перспективными оказались бактерии Bacillus subtilis, Pseudomonas aeraginasa, способные секретировать рекомбинантные белки в окружающую среду. Из эукариот хорошими продуцентами генно-инженерного интерферона являются дрожжи Sacchoromyces cervisiae, которые растут на достаточно дешевых средах, легче отделяются от культуральной жидкости, не подвергаются действию бактериофагов. При использовании данного вида дрожжей производство интерферона возросло в 10 раз. Клетки Sacchoromyces cervisiae действительно обладают особыми преимуществами при синтезе гликопротеидов высших организмов (например, интерферонов), поскольку присоединение углеводных групп (гликозилирование) в них осуществляется по тому же механизму, что и в клетках животных.
Принципиальная технологическая схема получения рекомбинантного интерферона включает следующие этапы:
1.Выделение иРНК, несущую информацию о структуре молекулы интерферона (РНК выделяют после индукции синтеза интерферона);
2.Получение кДНК на матрице иРНК;
3.Встраивание кДНК в векторную плазмиду с участием ферментов рестриктаз и лигаз и получение рекомбинантной ДНК (рДНК), содержащей ДНК вектора с генетическими маркерами и ДНК, кодирующую синтез целевого продукта;
4.Трансформация рДНК в рецепиентную (пермиссивную) микробную клетку;
5.Получение клонов рекомбинантных продуцентов, способных синтезировать интерферон (на плотной питательной среде);
6.Размножение клоновой культуры – продуцента в жидкой питательной среде;
7.Отделение клеток из культуральной жидкости центрифугированием;
8.Выделение целевых белков из нативного раствора или лизата биомассы продуцента, например, осаждением сульфатом аммония;
9.Очистка интерферона после растворения осадка с помощью аффинной хроматографии при использовании сорбента, связанного с моноклональными антителами к интерферону. При пропускании раствора, содержащего целевой продукт и балластные вещества через колонку с иммуносорбентом происходит высокоспецифическое связывание антигена (интерферона) с моноклональными антителами к нему, все прочие вещества не задерживаются. Затем интерферон элюируют слабой кислотой, происходит диссоциация комплекса «антиген-антитело».
Выполнение 1 – 5 этапов осуществляется в лабораторных условиях, последующие этапы выполняются на производственных установках. Выход рекомбинантного интерферона значительно выше, чем при использовании культур клеток микроорганизма (лимфоцитов, лейкоцитов, фибробластов). Для получения 60 мкг лейкоцитарного интерферона нужно 100 л крови или 1 л культуральной жидкости микроорганизма-рекомбинанта. Действие рекомбинантных ИНФ лишено видовых ограничений и не уступает эффекту природных по активности.
Дата добавления: 2015-12-08; просмотров: 1006 | Нарушение авторских прав