QS у грамположительных бактерий

У грамположительных бактерий наиболее подробно изучены несколько систем, принимающих участие в контроле вирулентности у Staphylococcus aureus, в регуляции компетентности (т.е. способности принимать экзогенную ДНК при трансформации) у Streptococcuspneumoniae, регуляции компетентности и споруляции у Bacillus subtilis. В качестве аутоиндукторов QS систем у грамположительных бактерий используются секретируемые пептиды, AIP. Среди них – линейные пептиды и пептиды, содержащие тиолактонное кольцо. Они узнаются специфическими рецепторами – двухкомпонентными, связанными с мембранами сенсорными гистидин-киназами. Пептидные сигнальные молекулы не диффундируют через клеточную мембрану; по-видимому, за выход их из клетки в среду ответственны экспортеры пептидов. При этом в большинстве случаев происходит процессирование и модификация пептидов. Различные грамположительные бактерии синтезируют различные пептидные сигнальные молекулы. Сигнальный механизм функционирует через каскад фосфорилирование/ дефосфорилирование. Сенсорная киназа фосфорилируется, после чего фосфорильная группа переносится на соответствующий белок - регулятор ответа. Фосфорилированный регулятор ответа связывается с ДНК и активирует транскрипцию гена-мишени.

Лучше всего изучена система QS у Staphylococcus aureus. S. aureus использует бифазную стратегию при инфекции макроорганизма. При низкой плотности популяции бактерий (первый этап инфекции) клетки продуцируют белковые факторы, способствующие их прикреплению и колонизации; при высокой плотности популяции (второй этап) бактерии репрессируют синтез этих факторов, и в них начинается секреция токсинов и протеаз; этот этап регулируется Agr QS системой. Система включает аутоиндуктор пептид AIP и agrBDCA -оперон. Ген agrD кодирует AIP, гены agrC и agrA - два двухкомпонентных белка, сенсор-киназы, AgrC и AgrA. Ген agrB кодирует белок, который экспортирует и модифицирует AIP (добавляет тиолактонное кольцо). Связывание AIP с AgrC приводит к фосфорилированию AgrA. Фосфорилированный AgrA индуцирует экспрессию регуляторной РНК (РНКIII), которая подавляет экспрессию факторов клеточной адгезии во время второго этапа инфекции. Активированный AgrA также индуцирует экспрессию agr оперона, что вызывает индукцию синтеза AIP.

Известны четыре группы S. aureus, синтезирующие AIP с различной последовательностью. Интересно, что каждый тип AIP активирует свой собственный рецептор AgrC, но ингибирует активацию рецепторных белков у трех остальных групп вследствие конкурентного связывания с этими белками; в результате, AIP каждой группы стафилококков подавляет активацию каскада вирулентности остальных трех групп S. aureus. В соответствии с такой стратегией, очищенный пептид AIP II группы стафилококков подавляет вирулентность S. aureus группы I при инфекции мышей.

Второй QS механизм, функционирующий в S. aureus, включает белок RAP (он же рибосомальный белок L2) и белок TRAP; последний является цитоплазматическим транскрипционным фактором. TRAP в фосфорилированном состоянии активирует РНК III; его фосфорилирование стимулируется белком RAP. Вирулентность S. aureus может ингибироваться пептидом RIP (RNA III inhibiting peptide). Пептид RIP ингибирует фосфорилирование белка TRAP, приводя к ингибированию синтеза РНК III, что приводит к подавлению синтеза токсина и снижению вирулентности клеток. Фосфорилирование TRAP может ингибироваться также в присутствии AIP; это показывает, что сложная сеть сигнальной трансдукции участвует в регуляции патогенеза S. aureus.

У других грамположительных бактерий, стрептомицетов, среди которых – основные продуценты антибиотических веществ, используемых в медицине, в качестве аутоиндукторов QS систем используются соединения иной природы - γ-бутиролактоны. QS у этих бактерий участвует в регуляции их морфологической дифференции и продукции вторичных метаболитов. Интересно, что сигнальные молекулы стрептомицетов структурно сходны с N-ацил0-гомосеринлактонами грамотрицательных бактерий. Неизвестно, однако, существует ли в природе коммуникация между этими таксономически далекими группами бактерий с использованием указанных сигнальных молекул.

QS система, использующая аутоиндуктор AI-2

Аутоиндуктор AI-2 был обнаружен впервые в клетках Vibrio harveyi; это соединение с необычной структурой, фуранозил-борат диэфир. AI-2 накапливается во второй половине экспоненциальной фазы роста, но содержание его резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу.

Синтазой AI-2 является белок LuxS, кодируемый геном luxS; гены luxS высоко гомологичны у разных бактерий. Фактически, ген luxS присутствует в половине всех секвенированных бактериальных геномов.

AI-2 продуцируется из S-аденозилметионина через три стадии; субстратом для LuxS-синтазы является S-аденозил-гомоцистеин, который далее превращается в аденин, гомоцистеин и 4,5-дигидрокси-2,3-пентандион (DPD). Из DPD, весьма реактивного продукта, легко перестраивающегося и вступающего в дополнительные реакции, могут образовываться сигнальные молекулы, которые различные виды бактерий распознают как AI-2. Недавно была определена структура еще одной сигнальной молекулы AI-2 у Salmonella typhimurium; это вещество фурановой природы отличается от AI-2 V. harveyi, в том числе,не содержит атома бора. Показано, что эти два AI-2 и их предшественники, образуемые из DPD, могут находиться в природных условиях в равновесии и легко взаимопревращаться. Предполагают, что появление бора в молекуле AI-2 V. harveyi может быть связано с высокой концентрацией этого элемента в морской воде, где обитает эта бактерия; в то же время его концентрация в условиях обитания S. typhimurium значительно ниже. Наличие бора в молекуле AI-2 V. harveyi и его отсутствие в AI-2 S. typhimurium, по-видимому, существенны для действия этих аутоиндукторов в клетках продуцирующих их организмов.

Таким образом, эти пока еще немногочисленные исследования QS систем, включающих аутоиндукторы типа AI-2, показали, что с помощью консервативного пути биосинтеза, использующего фермент LuxS, бактерии синтезируют интермедиаты сигнальных молекул, дальнейшая судьба которых может определяться особенностями окружающей среды.

У Vibrio harveyi рецепторным сенсорным белком является LuxP, непосредственно связывающий AI-2. Комплекс LuxP-AI-2 взаимодействует с мембранно-связанной гистидин-киназой LuxQ. При низких плотностях популяции бактерий LuxQ фосфорилируется, и фосфат переносится на цитоплазматический белок LuxU, а затем с этого белка на регуляторный белок LuxO, связывающийся с ДНК. Далее, происходит сложная цепь событий, включающих активацию генов, кодирующих пять маленьких регуляторных РНК, белком фосфо-LuxO и сигма 54 субъединицей РНК-полимеразы; эти РНК взаимодействуют с РНК-шапероном белком Hfq, что приводит к связыванию и дестабилизации мРНК, кодирующей активатор транскрипции LuxR. LuxR требуется для активации транскрипции lux оперона Vibrio harveyi; при низких плотностях популяции бактерий мРНК luxR деградирует, и в результате биолюминесценция отсутствует. При высоких плотностях популяции бактерий количество AI-2 сильно возрастает, что приводит к дефосфорилированию белка LuxO. Нефосфорилированный LuxO не может индуцировать экспрессию маленьких регуляторных РНК. В результате становится возможной трансляция мРНК luxR, синтез белка LuxR и биолюминесценция. Таким образом, в конечном итоге накопление AI-2 вызывает активацию экспрессии генов lux оперона. Большой интерес представляет факт, что в регуляции lux оперона V. harveyi принимают участие три вида аутоиндукторов QS систем, взаимодействующих между собой: AI-2, AHL (таб.) и CAI-1.

В настоящее время вопрос о роли AI-2 как сигнальной молекулы и регулятора экспрессии генов у разных бактерий остается недостаточно изученным и требует дальнейших исследований.

В отношении патогенных бактерий на основании изучения мутантов с инактивированным геном lux S было показано, что этот ген, считающийся геном синтазы AI-2, участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с вирулентностью энтеропатогенных штаммов E. coli, Vibrio cholerae, Streptococcus pyogenes. QS системы этого типа являются глобальными регуляторами экспрессии бактериальных генов; так, было показано, что lux S участвует в регуляции транскрипции 242 генов E. coli, составляющих 5,6% генома этой бактерии.

Среди бактерий семейства Enterobacteriaceae наиболее хорошо изучены QS-системы II типа у E. coli и S. typhimurium. У S. typhimurium обнаружены гены, кодирующие тип рецептора AI-2, отличный от рецептора AI-2 LuxP у V. harveyi. Это АТФ-зависимый транспортер, названный LsrB (от LuxS-regulated). Такой же рецептор AI-2 был обнаружен и у других представителей семейства Enterobacteriaceae. Оказавшись внутри клетки, AI-2 фосфорилируется и связывается с белком LsrR. В отсутствие AI-2 белок LsrR репрессирует lsr оперон. AI-2 накапливается во второй половине экспоненциальной фазы роста, содержание его в среде резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу. Клетки E. coli и S. typhimurium импортируют AI-2 при переходе в стационарную фазу с помощью транспортера Lsr.

На основании изучения эффекта мутаций, инактивирующих ген lux S, был сделан вывод о том, что синтаза LuxS участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с вирулентностью, у патогенных штаммов E. coli EHEC и EPEC - контролирует экспрессию системы секреции III типа, которую кодируют гены LEE-локуса, участвует в регуляции миграции клеток, формировании биопленок, в синтезе токсинов и др. Транскриптомный анализ показал, что LuxS является глобальным регулятором EHEC, контролируя экспрессию более 400 генов. Опубликовано большое количество данных, показывающих, что мутации в гене lux S приводят к отсутствию синтеза AI-2 и оказывают существенное влияние на клеточные процессы различных бактерий семейства Enterobacteriaceae: S. marcescens, Serratia sp., Erwiniacarotovora и amylovora.

Однако, в экспериментах по комплементации мутации в гене lux S при использовании выделенного и химически синтезированного AI-2 было установлено, что не все фенотипы, зависимые от lux S, контролируются непосредственно AI-2. Регуляторная роль AI-2 доказана точно для биолюминесценции штамма V. harveyi BB170 и экспрессии lsr -оперона у S. typhimurium. Эти результаты показали, что данные о влиянии AI-2 на некоторые свойства клеток, которые ранее считались зависимыми от QS системы II типа, должны быть пересмотрены с учётом того, что синтез AI-2 – это не единственная функция LuxS синтазы. В клетках бактерий с инактивированными генами lux S накапливается S-рибозил-гомоцистеин, так как не происходит его дальнейшее расщепление до гомоцистеина и DPD. В этом случае в клетке резко снижается уровень гомоцистеина, который необходим для синтеза метионина, и клетка будет использовать другие пути его образования, в частности, через оксалоацетат. Следовательно, изменение экспрессии различных генов у lux S-мутантов может определяться не (или не только) QS-регуляцией, но и серьезными нарушениями метаболизма бактерий, вызывающими плейотропные эффекты.

Чтобы ответить на вопрос, связано ли влияние lux S-мутантов на различные фенотипы бактерий с отсутствием функционирования QS-систем на основе AI-2, или это результат плейотропных эффектов при нарушении метаболизма, был проведен анализ геномных баз данных на наличие генов известных рецепторов AI-2 (LuxP-рецептора Vibrio harveyi и Lsr-рецептора S. typhimurium) Было высказано предположение, что зависимость фенотипов от QS регуляции II типа ограничивается преимущественно организмами, несущими гены рецепторов AI-2, а изменение фенотипов у lux S мутантов, не содержащих эти гены, можно объяснить нарушениями в клеточном метаболизме. Геномный анализ позволил установить наличие Lsr-подобных рецепторов AI-2 у представителей семейства Enterobacteriaceae, таких как E. coli, Photorhabdus luminescens, Klebsiella pneumoniae, Yersinia spp., Shigella dysenteriae и Shigella flexneri, Salmonella spp.

Гомологи известных рецепторов AI-2 не обнаружены в опубликованных банках последовательностей генов и белков бактерий родов Serratia и Erwinia. Хотя и не было неожиданностью отсутствие двухкомпонентной сенсорной киназы LuxPQ (этот рецептор до сих пор был найден только у представителей семейства Vibrionaceae), отсутствие в геноме этих бактерий и Lsr-рецепторного комплекса стало сюрпризом. Этот факт вызывает серьезные сомнения в существовании у них QS-систем, функционирующих с участием AI-2, и предполагает преимущественно метаболическую роль LuxS у этих бактерий. Хотя, конечно, нельзя исключить возможности наличия у них ещё не изученных рецепторов AI-2.

Таким образом, функции веществ типа AI-2 могут быть различными у разных бактерий. Однако, даже в тех случаях, когда эти вещества в составе QS систем не являются регуляторами экспрессии генов клетки-хозяина, они могут, выделяясь в среду, участвовать в регуляции клеточных процессов других бактерий в популяции, осуществляя их коммуникацию. Подобные взаимоотношения были показаны для искусственных смешанных популяций бактерий, состоящих из клеток E. coli и V. harveyi, а также V. cholerae, который может сосуществовать с E.coli в человеческом организме.

QS системы, использующие аутоиндуктор AI-3 и гормоны

AI-3 впервые был описан как компонент использованной культуральной среды штамма патогена EHEC, который активировал экспрессию генов, отвечающих за адгезию бактерий на эукариотических клетках. Эксперименты по изучению структуры AI-3 показали, что это соединение ароматической природы, высказано предположение об аминокислотной природе AI-3. Однако, полностью структура и механизм синтеза этой сигнальной молекулы еще не определены. Предполагается, что как и в случае АГЛ, имеется целое семейство соединений, подобных AI-3. Было показано, что синтез AI-3 не зависит от гена lux Sв E. coli, в отличие от синтеза AI-2. Обнаружили, что АI-3 активирует транскрипцию генов вирулентности LEE-локуса у EHEC штаммов E. coli. Для определения АI-3 были получены биосенсоры - штаммы E. coli K-12, содержащие в хромосоме конструкции на основе генов LEE-локуса и гена репортера lac Z. С помощью биосенсоров было обнаружено, что различные бактерии кишечной микрофлоры, непатогенные штаммы E. coli и Enterobacter cloacae и патогенные виды Shigella, Salmonella и Klebsiella, синтезируют

Для функционирования AI-3 у E. coli необходима двухкомпонентная система, включающая сенсорную киназу QseC и регулятор ответа QseB. В присутствии в периплазматическом пространстве AI-3 QseC вначале фосфорилируется, затем переносит фосфат на QseB, который связывается с соответствующими промоторами и вызывает активацию экспрессии собственного гена и генов flhDC -оперона, отвечающего за синтез жгутиков [118, 119]. AI-3 также участвует в регуляции генов LEE-локуса [113]. Обнаружена двухкомпонентная система, названная QseEF, ответственная за регуляцию этих генов.

QseCB и QseEF системы, кроме AI-3, отвечают на еще один класс сигнальных молекул – катехоламиновые гормоны, в частности, эпинефрин/норэпинефрин (или адреналин/норадреналин), синтезируемые организмом-хозяином. Анализ бактериальных геномов показал, что AI-3/эпинефрин/норэпинефрин сигнальные каскады присутствуют в большом количестве бактериальных видов.

QS и апоптоз у бактерий.

Кроме описанных выше QS систем, у E. coli обнаружена QS система, функционирующая с участием пептидов в качестве сигнальных молекул, которая участвует в регуляции апоптоза бактерий. Апоптоз или программируемая клеточная смерть (ПКС) - генетически обусловленная программа гибели клеток у многоклеточных эукариотических организмов. ПКС способствует нормальному функционированию биологической системы, освобождая ее от поврежденных, закончивших жизненный цикл или появившихся вследствие возникновения мутаций потенциально опасных клеток. Найдены системы со сходной функцией и у прокариот. Прокариотическим аналогом апоптоза можно считать гибель части клеточной популяции бактерий в условиях остановки роста популяции, например, в стационарной фазе роста при исчерпании питательного субстрата или под влиянием стрессовых факторов. В результате гибели и автолиза части клеток оставшиеся живые клетки могут использовать продукты автолиза как питательный субстрат и продолжать расти, синтезируя необходимые клеточные компоненты, что полезно для выживания бактериальных популяций. ПКС может способствовать обмену генетической информацией в популяции бактерий при высвобождении ДНК в результате лизиса клеток. Кроме того, уничтожение клеток с повреждениями генетического аппарата также полезно для популяции бактерий.

Генетические механизмы ПКС в прокариотических системах полностью не выяснены. Большое внимание было уделено изучению токсин-антитоксин систем (ТА-системы), обнаруженных у E. coli и других бактерий. ТА-модули состоят из пары генов в геномах бактерий: гена, кодирующего стабильный токсин, который вызывает гибель клеток, и гена, кодирующего лабильный антитоксин, который ингибирует активность токсинов; гены токсинов ко-транскрибируются с генами соответствующих антитоксинов в составе одного оперона.

Система E. coli maz EFявляется одной из наиболее изученных ТА-систем. Ген maz F кодирует стабильный цитотоксический белок, а maz E – нестабильный антитоксин, разрушаемый АТФ-зависимой ClpAP сериновой протеазой. Токсин MazF представляет собой эндорибонуклеазу, которая преимущественно расщепляет однонитевые мРНК в последовательности ACA и действует также на 16S РНК в декодирующем центре 30S субьединицы рибосомы, что приводит к ингибированию синтеза белка. До тех пор, пока MazE и MazF экспрессируются совместно, MazE взаимодействует с MazF, нейтрализуя его токсичное действие. В нормально растущих клетках токсин и антитоксин образуют стабильный комплекс, что мешает токсину осуществлять токсическое действие. В стрессовых условиях, которые препятствуют экспрессии maz EF-оперона, индуцированные стрессом протеазы разрушают MazE, и в результате стабильный токсин MazF может действовать на клеточные РНК, что приводит к гибели клеток и автолизу большей части популяции.

maz EF-опосредованный апоптоз зависит от плотности популяции, он регулируется QS-фактором EDF (extracellular death factor, внеклеточный фактор смерти). EDF является линейным пентапептидом Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. Было установлено, что EDF увеличивает активность MazF in vitro. В то же время, активация MazF приводила к увеличению синтеза EDF, что в свою очередь вызывало увеличение гибели клеток в стрессовых условиях. Было обнаружено прямое сайт-специфическое связывание EDF и MazF. Результаты проведенных исследований показывают, что QS система, участвующая в регуляции апоптоза у E. coli, кардинально отличается от описанных выше QS систем Enterobacteriaceae: 1) EDF – единственная сигнальная молекула пептидной природы, обнаруженная у E. coli; 2) большинство известных молекул, участвующих в функционировании QS, контролируют экспрессию генов на уровне транскрипции, а EDF – на посттранскрипционном уровне.

Недавно были обнаружены несколько небольших QS-пептидов, отличающихся по последовательности аминокислот от EDF, синтезируемых грамотрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa и грамположительной Bacillus subtilis, которые могли участвовать в регуляции клеточной гибели, управляемой maz EF[134]. Каждый из этих пептидов, несмотря на различия в строении, активировал эндорибонуклеолитическую активность MazF E. coli, по-видимому, взаимодействуя с различными сайтами этого белка. Таким образом, была обнаружена семья QS пептидов EDF, которая в дальнейшем может стать основой для получения регуляторов нового типа, активирующих ПКС.

Приведенные выше QS системы и участвующие в их функционировании аутоиндукторы не исчерпывают всех известных в настоящее время; число вновь открываемых постоянно увеличивается.

Ингибирование QS систем бактерий - новый подход к созданию лекарств против патогенности

Одной из важнейших проблем современной медицины является все большее распространение бактериальных возбудителей, устойчивых к традиционным лекарственным препаратам. Особенно ярко эта проблема иллюстрируется широким распространением госпитальных инфекций, которые регистрируются сейчас в отделениях интенсивной терапии более чем у 20% пациентов. Распространение устойчивых к лекарственным препаратам форм патогенных бактерий, снижающее эффективность и обесцениваюшее все большее количество обычно применяемых традиционных лекарственных средств, и необходимость разработки способов подавления образования бактериями биопленок ставит вопрос о новых стратегиях для борьбы с инфекционными заболеваниями, о создании лекарственных средств нового поколения, воздействующих на специфические биохимические системы микроорганизмов.

В настоящее время принято считать, что одной из наиболее перспективных «мишеней» подобного рода является Quorum Sensing регуляция. QS системы, как было отмечено выше, участвуют в регуляции вирулентности бактерий и формировании ими биопленок.

Лекарственные средства, направленные на подавление QS систем, предложено называть «ядами патогенности», т.к. они, в отличие от классических антимикробных лекарств (прежде всего, антибиотиков), не обладают бактерицидным или бактериостатическим действием на патогенные бактерии и поэтому не создают селективного давления, ведущего к образованию резистентных к антибактериальным веществам форм патогенных бактерий. В последнее время за рубежом образованы биотехнологические компании, которые ставят своей целью разработку средств, ингибирующих QS регуляцию и, вследствие этого, снижающих патогенность бактерий и предотвращающих образование ими биопленок.

Подавление функционирования QS систем может быть достигнуто несколькими способами.

Подавление синтеза аутоиндукторов QS систем.

Как упоминалось выше, S-аденозилметионин (SAM) является субстратом для синтеза аутоиндукторов AHL и AI-2 QS систем двух типов. Показано, что различные аналоги SAM, например, S-аденозилгомоцистеин, S-аденозилцистеин действовали, как сильные ингибиторы синтеза AHL у Pseudomonas aeruginosa. Следует отметить при этом, что взаимодействие AHL-синтазы с SAM, по-видимому, происходит очень специфично, несмотря на то, что SAM является обычным предшественником во многих прокариотических и эукариотических биохимических путях. Это позволяет надеяться, что аналоги SAM могут быть использованы как специфические ингибиторы синтеза аутоиндукторов бактериальных QS систем регуляции, не влияющие на ферменты эукариотов.

Показано, что некоторые антибиотики – макролиды, ингибиторы синтеза белка на рибосомальном уровне, подавляли синтез AHL и некоторых факторов вирулентности в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий. Например, субингибирующие концентрации эритромицина подавляли синтез AHL и факторов вирулентности гемолизина, протеаз, гемагглютининов у Pseudomonas aeruginosa. Бактерии, подвергнутые действию антибиотика, были менее вирулентны для мышей. Эти данные согласовывались с результатами клинических наблюдений, показавших эффективность применения низких доз эритромицина и других макролидов при инфекциях, вызванных штаммами P. aeruginosa, резистентных к этим антибиотикам. Азитромицин в концентрации 2 мкг/мл, не ингибирующей рост P. aeruginosa, подавлял синтез AHL, а также продукцию факторов вирулентности эластазы и рамнолипидов. При этом добавление в культуру AHL экзогенно приводило к восстановлению продукции этих факторов вирулентности, показывая, что именно синтез AHL являлся первичной мишенью действия антибиотика. Механизм действия антибиотиков – макролидов на синтез AHL остается в настоящее время неясным

Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими

регуляторными белками.

Подавление функционирования QS систем регуляции может быть достигнуто с помощью молекул антагонистов аутоиндукторов, которые мешают связыванию AI с молекулами рецепторных белков. Показано, что такие ингибиторы могут быть конкурентными AHL – в этом случае они структурно близки сигнальной молекуле аутоиндуктора и связываются с сайтом связывания AHL с рецепторным белком, но не активируют этот белок. Неконкурентные ингибиторы могут иметь слабое сходство с AHL, или вообще быть несходными с ним; эти соединения связываются с различными сайтами на рецепторном белке. В настоящее время подобные ингибиторы активно изучаются; поиск конкурентных ингибиторов проводится с использованием компьютерного дизайна.

Получены данные о ингибировании QS регуляции аналогами AHL, несущими модификации в различных частях молекул AHL – в ацильных цепях и гомосеринлактонном кольце. Было показано, что длина ацильной цепи имеет существенное значение для активности AHL. Аналоги AHL с более длинными ацильными цепями, чем у нативных AHL, могли быть ингибиторами активности QS систем. Замена в молекулах AHL 3-оксо-групп на 3-гидроксильные или метильные, введение ненасыщенных связей в ацильные цепи приводит к значительному снижению активности AHL.

Модификации в гомосеринлактонном кольце молекул AHL существенно влияют на их активность. Природные AHL являются l-изомерами; d-изомеры, в основном, биологической активности не проявляют. Наличие ацильной цепи, по-видимому, необходимо для биологической активности AHL. Замена гомосеринлактонного кольца на гомоцистеинлактонное уменьшало активность AI на порядок, а замена на гомосеринлактамное кольцо приводило к отсутствию активирующих или антагонистических свойств у этой молекулы. Однако, молекулы, в которых гомосеринлактон заменен на гомосеринтиолактон, могут сохранять активность при функционировании некоторых QS систем.

При изучении действия аналогов AHL Las системы P. aeruginosa с заменами в гомосеринлактонном кольце было показано, что отношение к этим заменам было различным в случае взаимодействия этих аналогов с RhlR и LasR белками. Этот факт может указывать, что два рецепторных белка P. aeruginosa отличаются существенно в

их сайтах связывания с AHL.

В последнее время большое внимание уделяется природным антагонистам QS аутоиндукторов, производным фуранонов, в том числе, галогенизированным. Было обнаружено, что австралийская красная водоросль Delisea pulchra синтезирует различные виды галогенизированных фуранонов; их продукция препятствует колонизации этой водоросли морскими бактериями, у которых QS система участвует в регуляции метаболических процессов, и, таким образом, защищает растения от действия бактерий. Фураноны D. pulchra содержат фурановое кольцо с замещенной в C-3 положении ацильной цепью и атомами брома в C-4 положении. Замещения в C-5 положении могут варьировать. Фураноны из природных источников галогенизированы в различных положениях атомами брома, иода или хлора.

После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D. pulchra, в различных лабораториях был проведен широкий скрининг веществ природного происхождения и получение химически синтезированных веществ, производных фуранонов, ингибиторов QS. Среди них были производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Было показано, что даже производное фуранона без ацильной цепи с двумя атомами брома было ингибитором QS системы P. aeruginosa. Было обнаружено, что производные фуранонов продуцируются различными организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и др..

Изучение механизма действия этих веществ на QS системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с AHL за сайт связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с белком – рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка.

Действие фуранонов в результате приводило к ингибированию клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции Vibrio fischeri; продукции факторов вирулентности, включая образование биопленок, и патогенеза P. aeruginosa; вирулентности Erwinia carotovora. Многие химически синтезированные фураноны были значительно эффективнее, чем природные. Представляет большой интерес факт, что синтетические фураноны были активны против бактерий в составе биопленок в тех же концентрациях, что и против QS регуляции планктонно размножающихся бактерий, в отличие от действия классических антибиотиков, используемых для борьбы с инфекциями P. aeruginosa; в последнем случае концентрация антибиотика при росте бактерий в биопленках должна была быть в 100-1000 раз выше.

Использование транскриптомного анализа позволило определить, что добавление к клеткам соединений фураноновой природы влияет на экспрессию 93 генов P. aeruginosa PAO1; функционирование 80% этих генов регулировалось с участием QS систем, например, гены, кодирующие эластазу, протеазу LasA, участвующие в синтезе рамнолипидов, феназинов, цианида, хитиназы.

Недавно было показано, что производное фуранона, продуцируемое водорослью D. pulchra, (5Z)-4-бромо-5-(бромометилен)-3-бутил-2(5H)-фуранон, ингибировало QS в клетках Escherichia coli с участием аутоиндуктора AI-2; это соединение подавляло также формирование биопленки и вызывало репрессию 56 генов E. coli, 79% которых индуцировалось AI-2. При действии указанного соединения внеклеточная концентрация AI-2 уменьшалась вдвое; предполагается, что этот эффект осуществлялся на посттранскрипционном уровне.

Приведенные выше данные показывают, что производные фуранонов перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, направленных против патогенности бактерий. Однако, испытанные в настоящее время соединения с ингибирующим QS регуляцию действием токсичны для применения в медицине. Актуальной задачей является их модификация и поиски новых, нетоксичных веществ для применения на практике.

Бактерии и эукариотические организмы продуцируют вещества иной природы, подавляющие QS регуляцию у бактерий – циклические дипептиды (дикетопиперазины); о них упоминалось выше как о соединениях, способных активировать QS систему. Предполагают, что они также взаимодействуют с сайтами связывания AHL с рецепторными белками.

Деградация AHL.

Деградация аутоиндукторов QS систем – один из перспективных путей борьбы с бактериальными инфекциями, регулируемыми этими системами. Разложение AHL может быть следствием действия специфических ферментов бактерий и высших организмов; кроме того, они могут разлагаться в результате щелочного гидролиза, при высоких pH, при повышенной температуре выращивания бактерий. В настоящее время проводится активный скрининг ферментов, деградирующих AHL, в первую очередь, лактоназ, разрушающих гомосеринлактонное кольцо.

Лактоназы, гидролизующие AHL, были найдены у бацилл; соответствующий белок был назван AiiA. Было показано, что присутствие этого фермента в клетках бактерий определяет в значительной степени их способность к подавлению фитопатогенных бактерий, у которых вирулентность регулируется QS системами с участием AHL. Перенос гена рекомбинантной AHL-лактоназы в клетки Pseudomonas fluorescens увеличивал способность штамма к биоконтролю заболеваний растений, вызванных фитопатогенными бактериями. Более того, было показано, что трансгенные растения, содержащие введенный ген aiiA, экспрессирующийся в растении, были существенно менее чувствительны к инфекции Erwinia carotovora. Введение гена aiiA в клетки этого фитопатогена снижало синтез AHL и в результате уменьшало активность пектолитических ферментов и проявление других симптомов гнили растений. Исследуется также потенциал AHL-ацилаз, продуцируемых бактериями, в деградации AHL.

Высшие организмы также обнаруживают механизмы специфической деградации AHL. Большой интерес представляют данные о том, что клетки эпителия дыхательных путей человека способны инактивировать AHL P. aeruginosa – 3OC12HSL, но не C4-HSL. Эта инактивация имеет, по-видимому, энзиматическую природу. Деградации подвергаются и другие AHL, например, C6-HSL. Способность к деградации AHL обнаружена у некоторых, но не у всех, клеток млекопитающих. Эта находка открывает новую область исследований и позволяет надеяться, что человеческий организм имеет еще одну линию защиты от бактериальных инфекций – через взаимодействие с QS регуляцией вирулентности бактерий.

Поиск и изучение ферментов, деградирующих аутоиндукторы QS систем – новый перспективный путь получения терапевтических агентов, направленных на борьбу с бактериальными инфекциями.

Дата добавления: 2015-10-23