Регуляция переноса веществ через мембраны

Как известно, любая живая клетка окружена мембраной — ее часто называют плазматической. Она избирательно проницаема и регулирует поступление в клетку ионов и молекул и выход их из клетки наружу.

Клеточные мембраны разного происхождения построены из двойного слоя фосфолипидов, в который включены полипептиды. Двойной липидный слой плазматической мембраны должен полностью препятствовать проникновению всех полярных молекул, каковыми в большинстве своем являются молекулы питательных веществ. Поэтому их поступление в клетку осуществляется с помощью специальных мембранных белков через модифицированные участки мембраны.

Небольшая группа веществ может поступать в клетку в результате пассивной диффузии, когда концентрация их в среде выше, чем концентрация в клетке. При этом они, видимо, не взаимодействуют со специфическими компонентами клеточной мембраны. Таким путем поступают в клетку вода, неполярные и малополярные молекулы газов (О₂, Н₂, N₂) и углеводороды.

При облегченной диффузии поступление веществ в клетку осуществляется с помощью специфических мембранных переносчиков, это мембранные белки, имеющие общее название пермеазы которые в ряде случаев индуцируются своими субстратами. Переносимое вещество связывается с пермеазой снаружи и освобождается внутри клетки. При облегченной диффузии так же как и при пассивной диффузии, переносимый субстрат движется по градиенту концентрации (т. е. от более высокой к более низкой концентрации), причем ни один из этих процессов не требует метаболической энергии.

Системы активного транспорта могут создавать внутри клетки концентрации растворенных веществ, которые в тысячи раз превышают их концентрации во внешней среде. Это обеспечивает возможность развития микроорганизмов в условиях низкого содержания питательных веществ. Активный транспорт характеризуется специфичностью по отношению к субстрату, которая обеспечивается мембранным переносчиком. Когда переносчик обращен к внешней поверхности мембраны, он имеет высокое сродство к субстрату, а когда обращен к ее внутренней поверхности — низкое. Благодаря этому субстрат как бы «накачивается» в клетку. Этот процесс сопряжен с затратой метаболической энергии, обеспечивающей диссоциацию субстрата и переносчика на внутренней поверхности мембраны. Так, с помощью механизма активного транспорта в клетку поступает лактоза. Как уже отмечалось, ее перенос осуществляется при участии β-галактозидпермеазы. Если блокировать образование энергии (например, азидом натрия), то активный транспорт лактозы прекращается. В этих условиях β -галактозидпермеаза катализирует облегченную диффузию дисахарида, обнаруживая одинаковое сродство к нему по обе стороны мембраны.

Источником энергии, обеспечивающим активный транспорт в клетки различных микроорганизмов, в большинстве случаев является трансмембранный электрохимический потенциал ионов водорода, который может создаваться за счет переноса электронов или распада АТФ под влиянием мембранной АТФазы. Переносчики, имеющие места связывания протонов и молекул субстрата, используют мембранный потенциал (протонодвижущую силу) для транспорта в клетку ионов водорода и питательных веществ. Связывание с протоном должно повышать сродство переносчика к субстрату, а высвобождение его от протона на внутренней поверхности мембраны — понижать это сродство. Такой совместный транспорт одним переносчиком двух субстратов в одном направлении называется симпортом в отличие от унипорта, когда переносчик транспортирует только один субстрат. Многие питательные вещества поступают в клетки микробов также за счет симпорта с ионами Na⁺ или К⁺. Существует еще механизм антипорта, когда один переносчик транспортирует два субстрата, но в противоположном направлении.

У микроорганизмов, в частности у Е. colt, обнаружены также системы активного транспорта, которые используют химическую энергию АТФ. Такие системы обычно функционируют с помощью расположенных в периплазме связывающих белков. Это водорастворимые белки, обладающие высоким сродством к некоторым аминокислотам, витаминам, пептидам, сахарам и органическим кислотам. Сами они не могут транспортировать субстраты через плазматическую мембрану, но способны стимулировать активность мембранных компонентов системы транспорта. Исследование мутантов бактерий, дефектных по синтезу определенных связывающих белков, показало, что они совершенно необходимы для активного транспорта их субстратов.

Предполагается, что физиологическая роль связывающих белков состоит в том, чтобы концентрировать в переплазматическом пространстве определенные соединения, имеющиеся в среде, а также в том, чтобы препятствовать выходу в среду питательных веществ, вытекающих из цитоплазмы.

В процессе активного транспорта из среды в клетку поступает немодифицированный субстрат. Однако у многих микроорганизмов есть транспортные системы, которые переводят питательное вещество в химически измененную форму, не способную проходить через мембрану наружу. Это так называемые системы транслокации (или переноса) групп. Процесс переноса групп напоминает активный транспорт, поскольку приводит к тому, что внутриклеточная концентрация химически измененного соединения может во много раз превысить концентрацию свободного соединения в среде. Примером системы переноса групп является фосфотрансферазная система (ФТС). Она транспортирует многие углеводы и их производные, поступающие в клетку в виде фосфатных эфиров (фосфоуглеводы).

При транспорте углеводов с помощью механизма переноса групп в клетке сразу же оказывается фосфорилированное производное. Таким образом, одновременно осуществляется первая реакция катаболизма углевода и, следовательно, экономится АТФ.

Важно подчеркнуть, что иногда одновременно с индукцией белковых компонентов необходим синтез фосфолипидов, в отсутствие которого транспортная система остается малоактивной. Это связано с тем, что мембранные белки нормально функционируют, когда они находятся в контакте с липидами. Активирующее действие этих соединений может быть двояким. Во-первых, в присутствии липидов может меняться форма молекулы мембранного белка, так что его активный центр становится доступным для субстрата. Во-вторых, липиды могут играть роль организатора ансамбля, состоящего из нескольких мембранных белков.

Свойства мембранных липидов могут изменяться, если в среду добавить различные жирные кислоты (или их производные), которые включаются в мембрану вместо нормальных. Кроме того, на содержание и состав липидов в мембране могут влиять мутации. В результате нарушаются функционирование транспортных систем и проницаемость мембран.

Избыток субстрата в среде может репрессировать синтез соответствующей транспортной системы. Это особенно характерно для аминокислот, регуляция транспорта которых, по-видимому, скоординирована с регуляций их метаболизма. Важным обстоятельством является участие в такой репрессии аминоацил-тРНК, что свидетельствует о тесном взаимодействии процессов транспорта аминокислот и их последующего использования в трансляции. Репрессия транспорта наступает при избытке соответствующих аминоацил-тРНК.

Как было указано в начале этого раздела, движение веществ через мембрану не является однонаправленным. Микроорганизмы освобождаются от токсичных продуктов собственного метаболизма, выделяют избыточные питательные вещества, многие виды продуцируют антибиотики и экзоферменты.

Определенные низкомолекулярные соединения могут выводиться наружу с помощью тех же механизмов пассивной и облегченной диффузии, когда концентрация их в клетке превышает концентрацию во внешней среде. Более того, некоторые микроорганизмы используют опосредованный переносчиками вывод метаболитов из клетки для создания протонодвижущей силы. Так, в клетках молочных стрептококков, Strept. cremorls, поступающие с помощью ФТС глюкоза и лактоза метаболизируются с образованием молочной кислоты. При этом внутриклеточная концентрация лактата может достичь уровня 200 мМ. Лактат выводится в симпорте с протонами, так что при оптимальных условиях среды (рН > 6, 7, концентрация лактата меньше 10 мМ) одна его молекула покидает клетку вместе с двумя ионами Н⁺. Установлено, что за счет этого клетка получает дополнительную энергию, эквивалентную 50% той энергии, которая генерируется в процессе субстратного фосфорилирования за счет катаболизма глюкозы.

Однако вывод из клетки многих метаболитов, по-видимому, осуществляется независимо от их поступления в клетку. Известны мутанты бактерий, у которых нарушен транспорт в клетку аминокислот и витаминов, но сохранилась способность к выделению этих соединений.

Предполагается, что многие метаболиты выводятся из клеток через особые каналы, или поры, в мембране. Эти каналы могут быть наподобие тех, которые существуют в наружной мембране грамотрицательных бактерий для диффузии небольших (< 800 Д) гидрофильных молекул. У Е. coli они образованы специальными белками, так называемыми поринами, продуктами генов ompF и ompС. Экспрессия этих генов зависит от осмолярности среды, причем осморегуляция осуществляется на уровне транскрипции.

Поры в плазматической мембране, возможно, возникают или начинают функционировать, когда концентрация того или иного соединения в клетке достигает определенного значения. Они могут быть важной частью системы регуляции метаболизма. Вместе с тем клетка стремится предотвратить потерю ценных питательных веществ. Как уже отмечалось, этой цели служат связывающие белки и другие компоненты систем активного транспорта, которые возвращают метаболиты в клетку, т. е. осуществляют их реаккумуляцию.

Показано, что некоторые соединения активно выводятся с помощью специфических энергозависимых систем экскреции. Так осуществляется вывод регуляторного нуклеотида цАМФ из клеток Е. coli и S. typhimurium и инозиновой кислоты (ИМФ) из клеток Brevibacterium ammoniagenes. Системы экскреции обеспечивают также выведение из клеток токсичных соединений и некоторых антибиотиков. Например, устойчивость к арсенату, арсениту и соединениям сурьмы у Е. сой и St. aureus связана с плазмидами и контролируется опероном, который, по-видимому, находится в составе транспозона. В присутствии токсичных ионов индуцируется их выброс из клетки, осуществляемый энергозависимой системой. Аналогичным образом связанная с плазмидами устойчивость к кадмию у St. aureus обусловлена активным выбросом из клетки катионов Cd²⁺.

Следует отметить высокую специфичность этих систем. Часто токсичные анионы и катионы поступают в клетку с помощью систем транспорта жизненно важных соединений. Обнаружено также, что детерминируемая некоторыми плазмидами устойчивость к тетрациклину у бактерий связана с активным выбросом его из клетки.

Отдельного рассмотрения требует вопрос об экспорте белков. Этим термином обозначают перемещение белков из цитоплазмы, где они синтезируются, в плазматическую мембрану, периплазматическое пространство, внешние слой клеточной стенки и в окружающую среду. Процесс выделения белков за пределы клетки называют также секрецией. Таким образом, секреция — это особый случай экспорта белков.

К секретируемым белкам относятся экзоферменты, осуществляющие гидролиз различных полимеров (белков, нуклеиновых кислот, поли- и олигосахаридов и липидов) до растворимых конечных продуктов, которые могут поступать в клетку и усваиваться микроорганизмами. Кроме того, секретируются разнообразные токсины, действующие на прокариотические и эукариотические клетки. Сюда же относятся так называемые лизирующие ферменты, способные разрушать клеточные стенки микробов. Наконец, секретируются ферменты, способные инактивировать некоторые антибиотики, например β-лактамаза.

Большинство экспортируемых белков синтезируется в виде предшественников, содержащих на аминоконцевом участке сигнальный (или лидерный) пептид, который не обнаруживается в зрелых белках. Сигнальные пептиды из эукариотических и прокариотических организмов представляют собой последовательности из 15—30 аминокислотных остатков, которые имеют ряд общих признаков: 1) на самом конце последовательности находится один или несколько положительно заряженных аминокислотных остатков; 2) существует непрерывный участок, содержащий восемь (или более) гидрофобных или нейтральных остатков; 3) имеется участок расщепления для сигнальной пептидазы, которому обычно предшествует консервативная последовательность.

Положительно заряженный участок, по-видимому, обеспечивает начальный контакт белка-предшественника с мембраной, внутренняя поверхность которой заряжена отрицательно, в то время как гидрофобные остатки формируют протяженный участок связывания с мембраной. Мутации, уменьшающие число положительно заряженных остатков или размеры гидрофобной области лидерного пептида, нарушают экспорт и процессинг белков.

Обычно белки, которые выводятся из цитоплазмы, синтезируются на связанных с мембраной полирибосомах (полирибосомы, или полисомы, образованы большим числом рибосом, присоединенных к транслируемой мРНК). Связывание полирибосом с мембраной происходит за счет гидрофобной области сигнального пептида. У эукариот экспорт белков всегда сопряжен с трансляцией. Энергия, освобождающаяся в процессе элонгации полипептидной цепи, обеспечивает и процесс экспорта. У прокариот, в частности у Е. coli, экспорт белков может осуществляться и после завершения трансляции и зависит от трансмембранного электрохимического потенциала. Здесь лидерный пептид, видимо, играет определенную роль в изменении конформаиии предшественника, обеспечивающей сохранение его до начала транслокации в растворенном состоянии в цитоплазме.

Зоны связывания на мембране, очевидно, образованы с участием специальных мембранных белков, ответственных за процесс экспорта. Причем различные участки, вероятно, могут быть избирательными по отношению к экспортируемым белкам. Определенную роль в процессе выведения белков нз цитоплазмы играют и рибосомы. Показано, что супрессорные мутации, восстанавливающие способность к экспорту белков с дефектной сигнальной последовательностью, могут затрагивать гены, контролирующие синтез рибосомных или мембранных белков.

Как уже отмечалось, процессинг экспортируемых белков осуществляется сигнальной пептидазой, которая расположена в мембране так, что каталитический участок фермента находится на ее наружной поверхности. Непосредственно перед окончанием трансляции или же вскоре после окончания происходит отщепление сигнального пептида и зрелый белок перемещается в определенные отделы клетки или за ее пределы. Однако в лидер-ном пептиде содержится не вся информация, необходимая для правильной локализации белка в клетке. Зрелый белок может включать дополнительные последовательности (стоп-трансферные сигналы, мембранные якоря), которые определяют, в частности, его расположение в пределах мембраны. Обычно это гидрофобные участки, напоминающие аналогичные последовательности сигнальных пептидов, детерминирующие задержку белка в липидном двуслое. В зависимости от характера расположения этих участков в пределах полипептидной цепи белок может или целиком размещаться в пределах мембраны, или же присоединяться к ней за счет концевой области. По-видимому, некоторые ферменты, которые остаются всегда связанными с поверхностью клетки, фиксированы в мембране подобным образом.

Следует отметить, что многие белки плазматической мембраны синтезируются без лидерного пептида, а имеют только внутренний «мембранный якорь». С другой стороны, секретируемые белки почти всегда образуются с аминоконцевым сигнальным пептидом и не содержат внутренних стоп-трансферных последовательностей.

Генетические и в особенности генно-инженерные методы позволяют соединить участок ДНК, несущий регуляторную область и сигнальную последовательность одного белка, с участком ДНК, кодирующими аминокислотную последовательность другого белка. В результате в клетке синтезируется гибридный или химерный белок. Такого рода эксперименты показали, что различные сигнальные последовательности эукариот и прокариот обычно взаимозаменяемы и обеспечивают выведение из цитоплазмы экспортируемых белков. Однако если второй белок в норме является цитоплазматическим, то экспорт его чаще всего не происходит. Иногда это связано с тем, что такие белки содержат внутренние участки, которые напоминают стоп-трансферные последовательности и поэтому «застревают» в мембране. Кроме того, у прокариот, где экспорт не сопряжен строго с трансляцией, может иметь значение неспособность образующихся химерных молекул принять конформацию, необходимую для последующей их транслокации из цитоплазмы.

Изменение работы систем, обеспечивающих перенос веществ через мембраны, является важным методом повышения продуктивности промышленных штаммов микроорганизмов. С этой целью используют физиологические факторы и мутации, не специфически повышающие проницаемость плазматических мембран, а также мутации, активирующие выделение метаболитов из клетки или нарушающих их реаккумуляцию.

Дата добавления: 2015-07-07