Осмотический сенсор

Осмотическим стрессом можно назвать то, что ощущают клетки из-за резкого изменения концентраций растворенных веществ в окружающей среде и цитоплазме.

При повышении осмотического давления внешнего раствора клетки теряют воду и уменьшаются в объеме. При снижении накачивают воду внутрь и увеличиваются в объеме. В том и другом случае клетки активируют мембранные белки-переносчики, а также генные блоки, отвечающие за адаптацию. В норме, как правило, они являются молчащими.

Наиболее интересными вопросами в изучении восприятия клетками осмотического стресса являются обнаружение сенсорных белков в цитоплазматической мембране, которые чувствуют изменения свойств мембраны во время гипо- или гиперосмотического стресса, а также выяснение механизмов последующей передачи сигналов, приводящих к активации адаптационных систем.

В этих процессах значительную роль играют регуляторные белки – киназы, свойством которых является присоединение фосфатной группы к другим белкам-регуляторам (фосфорилирование) либо к определенным аминокислотам в составе собственной молекулы (автофосфорилирование). Добавление фосфатной группы обычно кардинальным образом меняет свойства белков, превращая их из неактивной в активную форму. Особую роль в восприятии сигналов играют киназы, относящиеся к семейству гистидин-киназ, в которых (авто)фосфорилируются определенные остатки гистидина.

Одним из известных белков, воспринимающих изменения осмотического давления – осмосенсоров, в клетках прокариот является гистидин-киназа KdpD, связанная с цитоплазматической мембраной.

Ген kdpD, кодирующий этот белок, входит в оперон, состоящий из шести генов. Опероном называют близко расположенные гены, отвечающие за определенный признак или функцию и транскрибируемые под общим контролем одного регуляторного элемента в ДНК – промотора.

Этот оперон, называемый kdpFABCDE, кодирует систему переноса ионов калия, которые сами по себе или во взаимодействии с глутаминовой кислотой участвуют в регуляции объема и ионного баланса в цитоплазме клеток при гиперосмотическом стрессе. Четыре гена этого оперона кодируют АТФазу, транспортирующую ионы К⁺ (рис. 2). Кроме того, в состав оперона входят два гена, выполняющие регуляторные функции: кодируют саму сенсорную киназу KdpD и регулятор ответа KdpЕ.

Так, регуляцию экспрессии этого оперона осуществляет гистидин-киназа KdpD. Данный процесс проходит в несколько стадий:

ü под действием гиперосмотического стресса гистидин-киназа KdpD может фосфорилировать определенный остаток гистидина в своей молекуле;

ü затем фосфорилированная гистидин-киназа KdpD передает фосфатную группу на регулятор ответа KdpE (кодируемый геном kdpE), что приводит к его активации;

ü регулятор KdpE, в свою очередь, связывается с регуляторной областью промотора рассматриваемого нами оперона, что приводит к его активации;

ü это ведет к усилению синтеза К⁺-АТФазы и ускоренному транспорту ионов калия в клетки (см. рис. 2), что помогает им адаптироваться к новым осмотическим условиям.

Таким образом, данная регуляторная цепь относится к классу бикомпонентных систем восприятия и передачи сигналов, широко распространенных у бактерий, грибов и растений.

Первый компонент этой системы – сенсор, являющийся гистидиновой протеин-киназой (KdpD). Второй компонент – регулятор ответа KdpE, выполняющий роль трансфактора, включающего транскрипцию оперона kdpFABCDE.

Рис. 2. Регуляция экспрессии оперона kdp. A – сенсорная гистидин-киназа KdpD четырьмя трансмембранными доменами пронизывает цитоплазматическую мембрану клетки, нахо­дясь в неактивной форме. При гиперосмотическом стрессе мембрана сжимается, трансмембранные домены киназы сближаются, что приводит к изменению конформации KdpD и автофосфорилированию гистидинового остатка. Таким образом, KdpD переходит в активную форму. Далее фосфатная группа переносится с KdpD на остаток аспартата, находящегося в домене получения сигнала растворимого белка – регулятора KdpE. Этот белок также имеет участок связывания с регуляторной областью оперона kdp, но в нефосфорилированном виде не связывается с ДНК. После фосфорилирования KdpE переходит в активную форму и связывается с регуляторным участком (промотором) оперона kdp, активируя его транскрипцию.

Гены, входящие в оперон kdpFABCDE, отвечают за следующие функции:

KdpFABC кодирует К⁺-АТФазу, в которой KdpF является низкомолекулярной субъединицей, предположительно стабилизирующей К⁺-АТФазу.

Молекулярные механизмы, приводящие к автофосфорилированию сенсорной киназы KdpD, остаются неясными, однако предполагается, что она воспринимает либо изменение в напряжении мембраны, связанное с осмотическим стрессом, либо изменение ионной силы в цитоплазме. Было обнаружено, что оперон kdpFABCDE можно индуцировать не только осмотическим шоком, но и при нормальных осмотических условиях с помощью химических реагентов прокаина и хлорпромазина, которые реагируют с молярными группами мембранных липидов и вызывают изменение текучести мембран.

Кроме описанной выше сенсорной киназы KdpD существуют и другие осмосенсоры. Например, сенсорные киназы EnvZ.

Изменение текучести мембраны под действием осмотического стресса стимулируют фосфорилирование сенсорной киназы – EnvZ, а также вызывают перенос фосфатной группы с гистидинового остатка киназы EnvZ на остаток аспарагиновой кислоты в регуляторе ответа OmpR, который относится к тому же семейству регуляторов, что и KdpE. Эти данные свидетельствуют о том, что осмосенсоры KdpD и EnvZ могут регулироваться через изменение физического состояния мембранных липидов и благодаря этим изменениям запускать сигналы, приводящие к активации генов, необходимых для адаптации клетки к стрессу.

Одним из способов приспособления клетки к осмотическому стрессу является не только увеличесние содержания ионов К⁺ внутри клетки с помощью активации киназ KdpD и EnvZ, но и транспорт в клетку различных осмопротекторов. Например, глицин-бетаина.

Глицин-бетаин (бетаин или триметилглицин) является так называемым осмопротектором – веществом, накапливающимся в цитоплазме клеток и позволяющим регулировать их объем и тургорное давление при гиперосмотическом стрессе, когда в окружающей среде повышается концентрация осмотически активных веществ.

Установлено, что эти специфические переносчики глицин-бетаина демонстрируют зависимость своей активности от текучести цитоплазматической мембраны.

Поступление данного вещества в клетку обусловлено работой переносчиков глицин-бетаина разного типа. Ниже будет дана краткая характеристика их морфо-функциональных особенностей.

В мембранах клеток идентифицировано и описано 2 типа переносчиков глицин-бетаина:

Ø классический АВС-переносчик состоит из пяти субъединиц:

ü две АТФ-связывающие (OpuАС),

ü две трансмембранные (OpuАВ)

ü одна рецепторная (OpuАС).

В случае обычного ABC-переносчика глицин-бетаина субстратсвязывающая субъединица OpuАС, являющаяся гидрофильным белком и присутствующая в периплазме в избытке, взаимодействует с субстратом и доставляет его транспортирующему комплексу OpuАВ. Гидролиз АТФ субъединицей OpuАА обеспечивает однонаправленный транспорт глицин-бетаина внутрь клетки (рис. 3);

Ø OpuA-переносчик представляет собой основную систему клеток, отвечающую за транспорт глицин-бетаина внутрь клеток и, таким образом, защищающую их от гиперосмотического стресса (рис. 3). OpuA из молочнокислых Lactococcus lactis состоит из четырех субъединиц:

ü две АТФ-связывающие субъединицы OpuАА;

ü две гибридные субъединицы OpuАВС, представляющие собой слитые в один полипептид трансмембранный и рецепторный белки.

В случае L. lactis гибридная трансмембранная субъединица OpuАВС отвечает за узнавание, связывание и транспорт субстрата. Исследование OpuA L. lactis в интактных клетках и системе искусственных фосфолипидных мембран показало, что эта система необходима и достаточна для активации транспорта глицин-бетаина внутрь клеток, что обеспечивает устойчивость клеток к гиперосмотическому стрессу. Видимо, OpuA работает как бифункциональная система, являясь одновременно и осмосенсором и осморегулятором.

Природу сигналов, активирующих OpuA, исследовали с использованием реагентов, изменяющих текучесть мембран. При этом было обнаружено, что катионные соединения тетракаин и хлоропромазин, а также анионный дипиримидин, взаимодействующие с полярными группами фосфолипидов, что должно менять их текучесть, активируют OpuA в нормальных изоосмотических условиях в такой же степени, как и гиперосмотический стресс. И хотя текучесть мембран не была напрямую измерена в этих работах, представленные данные позволяют предположить, что активация OpuA происходит в результате изменения физического состояния (текучести) мембран.

Рис. 3. Сравнение структуры переносчика OpuA Lactococcus lactis с классическими бактериальными переносчиками ABC-типа.

Классический ABC-переносчик: субъединица OpuАС связывает субстрат (глицин-бетаин) и направляет его к домену переносчика, состоящему из двух идентичных или гомологичных субъединиц OpuАВ и двух АТФ-связывающих субъединиц OpuАА. Гидролиз АТФ обеспечивает однонаправленный транспорт субстрата через мембрану;

OpuA переносчик L. lactis: трансмембранный домен OpuАВС представляет собой гибридный полипептид, состоящий из субстратсвязывающей и переносящей субъединиц.

Дата добавления: 2015-07-08