Материалы и методы исследования. 1. Полиакриламидный гель, в состав которого входит 22 %-ный раствор 0,1 М солевой

1. Полиакриламидный гель, в состав которого входит 22 %-ный раствор 0,1 М солевой фосфатсодержащей буферной смеси рН 7,4–7,6.

2. 0,06 М натрий-барбитуратный буфер рН 8,6.

3. 0,1 М солевая фосфатсодержащая буферная смесь рН 7,6.

4. 5 % раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в 2 Н соляной кислоте.

5. 0,1 Н раствор NаОН.

6. Фиксирующая смесь: метанол: вода: уксусная кислота = 10:10:1.

7. Краситель: 0,1 %-ный раствор толуидинового синего в 3 % уксусной кислоте.

8. 3 % раствор уксусной кислоты.

9. Стандарт коммерческого препарата гепарина 50 ЕД/мл.

10. Эллюирующий раствор: смесь 0,1 М СаСl₂: этанол (0,3 мл: 0,7 мл).

11. Аппарат для горизонтального гельэлектрофореза «АГГЭ-3».

12. Фотоэлектроколориметр ФЭК-56 М.

13. Центрифуга лабораторная на 3000 об/мин.

Ход определения. Берут биологический образец, в котором необходимо определить содержание гепарина, например, плазму, сыворотку, биологическую ткань, высушивают при температуре 60 °С, а затем измельчают. Навеску пробы 50 мг экстрагируют 3 мл солевой буферной фосфатной смесью при рН 7,6 на протяжении 2-х часов при температуре 60 °С. Два мл экстракта смешивают с равным объемом 5 %-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты для осаждения мукополисахаридов. После преципитации последних пробу центрифугируют. Полученный осадок мукополисахаридов растворяют несколькими каплями 0,1 Н раствора NаОH и доводят объем до 1 мл барбитуратным буфером рН 8,6. Далее 0,02 мл этого раствора вносят в лунки, содержащие полиакриламидный гель.

Проводят электрофорез, используя барбитуратный буфер рН 8,6 при напряжении 140–180 В и силе тока 20–40 мА на протяжении 30–40 мин. В качестве стандарта используют 0,5 ЕД гепарина (0,00385 мг), которые проводят через все этапы исследований. После окончания электрофоретического выделения гепарина, гелевую пластину помещают в фиксирующий раствор на 10–15 мин., а далее на 15–20 мин. — в раствор красителя. При этом на синем фоне окрашенной гелевой пластины проявляются пурпурного цвета зоны локализации гепарина. Затем гелевые пластины отмывают в 3 %-ном растворе уксусной кислоты, вследствие чего происходит изменение цвета этих пятен на сине-фиолетовый. Выделенный таким образом гепарин подлежит количественной оценке денситометрически, или путем колориметрической процедуры, которая нами и применялась. Соответственно уровню электрофоретической миграции пятна гепарина-стандарта и исследуемые зоны вырезали и экстрагировали, помещая их в 3 мл эллюирующего раствора. Полученные эллюаты фотоколориметрировали на ФЭК-56 М в кюветах с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 597 ± 10 нм. Количество гепарина в пробе оценивали относительно стандарта (мкг/г).

Дата добавления: 2015-10-28