Хламидии имеют много общего с рикеттсиями, но они передаются непосредственно от хозяина хозяину воздушно- капельным или половым путем. Гр-. Обитают на слизистых оболочках, их можно отнести к нормальной микрофлоре если они находятся в небольшом количестве. Помимо человека, они вызывают заболевания у птиц - орнитоз, пситаккоз. Геном маленький. Облигатные внутриклеточные паразиты, вне клетки хозяина не размножаются. Культивируются как рикеттсии. Метаболически зависимы от клетки - хозяина. Внутри клетки хозяина образуют 2 формы: Элементарное тельце - очень мелкие клетки, похожие на покоящиеся формы рикеттсий. Инфекционны. Проникают в клетку-хозяина, где из этой формы образуются ретикулярные тельца, которые внутри клетки хозяина бинарно делятся, затем снова переходят в элементарные тельца. Скопления телец внутри клетки-хозяина - это внутриклеточные включения, их обнаруживают иммунно-люминесцентной микроскопией, окраской по Романовскому-Гимзе. Заболевание, вызываемое хламидиями – хламидиоз - воспалительные процессы слизистых. Новорожденные могут заражаться при прохождении через родовые пути матери. У них часто возникают конъюктивиты.
15. Морфологическая характеристика грибов.
Грибы (Myces) относятся к эукариотам. Грибов в природе огромное количество и только небольшая их часть вызывает заболевания животных и человека. Основной структурный элемент грибов – гифы - нитевидные структуры, переплетающиеся между собой. В результате переплетения гиф образуется мицелий. Грибы в лабораторных условиях культивируются на специальных питательных средах, где образуют мицелий как поверхностный(воздушный), так и субстратный.
Грибы размножаются спорами бесполым путем. Высшие грибы размножаются половым путем: 2 споры сливаются, образуя зиготу. По образованию спор грибы делятся на низшие и высшие. У низших грибов помимо особенности спорообразования мицелий одноклеточный несегментированный. У высших грибов мицелий делится перегородками на отдельные клетки. В перегородках находятся отверстия.
У низших грибов споры образуются в специальных закрытых спорангиях. Споры, закрытые оболочкой спорангия, называются эндоспорами. У высших грибов экзоспоры- соприкасаются с внешней средой.
Артроспоры - гиф мицелия начинает дробиться и каждый образующийся при этом фрагмент дает начало новому мицелию.
Хламидоспоры - на концах в местах сочленения мицелия образуются выпуклости, одна из которых утолщается и превращается в спору.
Бластоспоры - характерны для дрожжевого грибка. От материнской клетки отпочковываются дочерние.
Аскоспоры - это половые споры, не образующие мицелий.
Классы грибов:
- Овомицеты.
- Аскомицеты (сумчатые).
- Базидиомицеты.
- Несовершенные грибы или дейтеромицеты.
Патогенность грибов.
Грибы у человека способны вызывать микозы, как поверхностные (поражения кожи, ногтей, волос), так и глубокие (мышцы, клетчатка). Грибы могут вызывать системные поражения. Криптокиккоз - заболевания, вызываемые грибком на фоне ВИЧ-инфекции (в 30% случаев). Заболевание вызывает Cryptococcus. Он имеет дрожжеподобные клетки размером 4- 20 мкм. Образует бластоспоры. Нитчатые формы отсутствуют. Может образовывать капсулу.
Blastomyces вызывает бластомикоз. Встречается в двух формах - висцеральный и кожный. В тканях определяются довольно крупные дрожжеподобные клетки.
Candida - входит в состав нормальной микрофлоры. У маленьких детей часто наблюдается кандидоз полости рта - молочница. Активизируются на фоне иммунодефицита.
Hystoplasma - Гистоплазма - вызывает гистоплазмоз. В клетках, тканях образует одноклеточные образования округлой или грушевидной формы. Образует бласто- и хламидоспоры. На питательных средах дает воздушный мицелий.
Coccidioides вызывают системное заболевание кокцидиоз, острая форма напоминает грипп. При хронической форме поражается костная ткань. Образует эндоспоры. На питательных средах образует воздушный мицелий. Часто встречается на фоне ВИЧ-инфекции.
16. Морфологическая характеристика актиномицетов.
Actinomyces - Актиномицеты - Лучистые грибы. Неистинные грибы. Относятся к почвенным бактериям. При своем росте образуют структуры, напоминающие мицелий грибов, т.е. они являются промежуточной формой микроорганизмов. С грибами их роднит мицелиообразование и спорообразования (бласто-, артро- и хламидоспоры). С бактериями - обитают в почве, Гр+, видны под световым микроскопом с иммерсией. Имеют ядерный материал, ЦПМ, клеточную стенку. Делятся обычным делением и спорами. На питательных средах образуют нечто похожее на субстратный мицелий. Выделяют 3 группы:
1) Псевдоактиномицеты - некоторые бактериальные формы, например микобактерии туберкулеза, бифидобактерии. Для этой группы характерна удлиненная форма и специфическое деление.
2) Проактиномицеты. У этих микроорганизмов сохраняется мицелий, образуют артроспоры. К ним относятся Nocardia- вызывают нокардиоз.
3) Эуактиномицеты - истинные лучистые грибки. Представитель - род Sthreptomyces. Образуют истинный мицелий, артроспоры. Могут образовывать спорангии (стрептоспорангии), экзоспоры по типу высших грибов. Эта группа дает до 95% антибиотиков.
17. Морфологическая характеристика простейших.
Простейшие (Protea) – одноклеточные живые существа. Морфологически их делят на: амебовидные, инфузории,
18. Химический состав бактерий. Пептидогликан, тейхоевые кислоты, липополисахарид – структура, механизмы биологического действия.
Микроорганизмы по своему химическому составу похожи на другие живые формы. 75-80% содержания воды. Белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты.
Белки входят в состав бактерий в виде простых, сложных, комплексных соединений, в состав липопротеидов. Белки выполняют роль ферментов. Различают структурные белки и ферменты.
Жгутики. В их состав входят белки- флаггелин- полимерное белковое соединение. Он состоит из отдельных компонентов линейной молекулярной формы, скрученных в виде канатов. Белок, входящий в состав жгутиков, обладает выраженными антигенными свойствами. На этот антиген жгутиков в макроорганизме вырабатывабтся антитела и сенсибилизированные лимфоциты.
Пили состоят из белка пилина. Этот белок обладает антигенными свойствами, но у многих микроорганизмов он гомологичен по аминокислотному составу.
Наружная мембрана Гр+ и Гр- бактерий содержит чистые белки или их комплексные соединения. Например, золотистый стафилококк имеет чистый белок- белок А. Этот белок располагается на наружной мембране и может связываться с молекулой IgG. У стрептококков имеется белок М. Этот белок может связываться с молекулой иммуноглобулина G, у стрептококков выполняет функцию адгезина с помощью которого стрептококки связываются с мембраной клеток. Чистый белок входит в состав капсулы некоторых микроорганизмов.
Полипептидная капсула имеется у возбудителя сибирской язвы.
Клеточная стенка – у Гр+ и Гр- микробов. Белок входит в состав пептидогликана. У Гр+ бактерий пептидогликан расположен в несколько слоев. Пептидогликан в природе имеется только в составе бактерий и является самым мощным раздражителем иммунной системы макроорганизма. Для бактерий он обеспечивает механическую устойчивость, выполняет роль каркаса. Пептидогликан обладает рядом биологических активностей:
- Является довольно сильным антигеном.
- Обладает пирогенными свойствами, т.е. вызывает лихорадочное состояние.
- Вызывает воспалительные реакции в сосудах кишечника.
- Адъювантные свойства - усиление иммунного ответа.
Белки встречаются также в составе ЦПМ. Она имеет 2 белковых слоя- наружный и внутренний, между которыми- слой липидов. Цитоплазма, рибосомальные белки отличаются от белков эукариотических клеток константой седиментации- скоростью осаждения в ультра- центрифуге. У бактерий она составляет 70S и 80S у эукариот. Действие ряда антибиотиков блокируют синтез белка рибосомами бактерий.
Ядерный материал белка не имеет. У микроорганизмов имеются особые белки, которые способны связывать атомы железа. Эти белки- сидерофоры или аэробактин. Эти белки усиливают патогенные свойства микроорганизмов. Вдоль каналов бактериальных клеток, по которым проходят питательные вещества, содержатся белок, имеющий большое значение в обмене веществ- порин.
Липиды микроорганизмов.
- Способны к ориентации
- Способны к агрегации
- Играют большую роль в обменных процессах.
- Состоят из жирных кислот, в основном насыщенных- С15-С18. У Гр- микробов- С16- С18. Часть жирных кислот обладает выраженными патогенными свойствами- миколовая, фтионовая. По спектру летучих жирных кислот часто проводят идентификацию микроорганизмов.
Углеводы. У микроорганизмов встречаются редкие углеводы, характерные только для них- маннитол, эритритол. Углеводы имеются в составе капсулы. Особенно много полисахаридов в клеточной стенке у Гр+.
Углеводы и липиды у Гр- бактерий образуют сложный комплекс - ЛПС-липополисахарид. Он состоит из 3 структурных компонентов:
1- Липид А.
2- Сердцевинный полисахарид.
3- О-боковая цепь.
ЛПС обладает свойствами эндотоксина, выраженными антигенными свойствами(О- антиген). Липид А обеспечивает токсические свойства полисахарида, и если из состава ЛПС удалить липид А его токсические свойства теряются. Сердцевинный полисахарид обладает антигенными и иммунномоделирующими свойствами. О- боковая цепь является специфическим свойством. В зависимости от ее строения проводится серологическое типирование бактерий. Она состоит из различных углеводов, сахаров(галактоза, глюкоза, манноза), специфичных только для бактерий сахаров: абеквоза, паратоза, политоза.
ЛПС оказывает следующие воздействия на организм:
1) обладает пирогенным действием Þ вызывает лихорадку
2) вызывает гемодинамические расстройства и нарушения ССС, резко уменьшает АД
3) вызывает агглютинацию ФЭ крови Þ тромбоз
4) вызывает диарейные состояния
5) является митогеном и стимулирует В-лимфоциты
6) обладает АГ свойствами
7) стимулирует образование цитокинов, а они в свою очередь действуют на др системы МКÒ, может даже вызвать шоковое состояние
вызывает ЭНДОТОКСИНОВЫЙ ШОК
ЛПС может вызывать лейкоцитоз, обладает протекторными свойствами – сдерживает рост и размножение раковых ##, ↓ чувствительность ## МКÒ к ИО.
Бактерии, имеющие полный состав ЛПС, образуют S-колонии. Эти колонии имеют ровные края, гладкую поверхность, более выраженные патогенные свойства. Бактерии с нарушенным синтезом ЛПС (отсутствует О-боковая цепь и часть сердцевинного полисахарида) образуют R-колонии: неровный край, шероховатая поверхность, сниженные патогенные свойства. Для выделения ЛПС из микробной клетки используется:
- Трихлоруксусная кислота.
- Водно-фенольная экстракция.
В чистом виде ЛПС выпускается промышленностью, используется как иммунностимулятор, в основном используется его полисахаридная часть без липида А. В зависимости от концентрации липополисахарида он вызывает в организме:
- Пирогенные эффекты.
- Гемодинамические расстройства со стороны ССС.
- Коагуляцию клеточных элементов крови, плазмы, в результате чего образубтся тромбы.
- Диарею.
- Митогенные свойства, стимулирует образование В- лимфоцитов.
- Антигенные свойства.
- Адъювантные свойства.
- Соногенные свойства.
Очень большое значение имеет эндотоксиновый шок. ЛПС может задерживать рост раковых клеток. Способствует снижению чувствительности макрооранизма к радиоактивному излучению.
19. Ферменты бактерий. Основные классы, генетический контроль, классификация, характеристика ферментов вирулентности.
Ферменты участвуют во всех обменных процессах. Ферменты делятся на экзоферменты, которые выделяются в окружающую среду, где они расщепляют питательные вещества. Эти вещества поступают внутрь клетки, где расщепляются эндоферментами.
По постоянству действия:
- Ферменты, постоянно участвующие в обменных процессах - конституитивные. Они принимают активное участие в синтезе структурных компонентов.
- Ферменты, действующие только при наличии субстрата – адаптационные: ферменты транспорта и катаболизма лактозы – галактоздпермиаза, b-галактозидаза, галактозидацетилтрансфераза.
В целях диагностики определяют такие ферменты моргов: лецитиназа, уреаза, сахараза, мальтаза, гиалуронидаза,
Ферменты патогенности:
1) гиалуронидаза – расщепляет ГАГ (матрикс соедин. ткани), что облегчает механическое продвижение по ткани
2) уреаза – расщепляет мочевину с образованием аммиака, что помогает выжить в очень кислой среде
3) гемагглютинины – запускают агглютинацию крови, что создает благоприятные условия для роста и размножения моргов.
4) лецитиназа – расщепляет желток куриного яйца
5) пенициллаза – расщепляет пенициллин (первый антибиотик)
20. Метаболизм микроорганизмов. Механизмы поступления веществ. Классификация и состав питательных сред.
Микроорганизмы используют питательные вещества для построение компонентов бактериальной стенки и для получения энергии. По характеру захвата пищи бактерии относятся к ОСМОФИЛАМ, т.е. питаются веществами, растворёнными в воде. Как и др мкÒ они нуждаются в большом кол-ве минеральных в-в (С, О, N, S, Р, Са, Fe и др).
Основным источником углерода для б! могут служить неорг соед-я (чаще СО2), из которых мкÒ синтезирует орг в-ва – это АУТО- или ФОТОТРОФЫ (синегнойная палочка). Если же мкÒ нуждаются в орг соед-ях, к/е служат им источником углерода и азота, то их наз. ХЕМО- или ГЕТЕРОТРОФАМИ. В результате ассимиляции и окисления орг в-в (из прир соед-й чаще всего исп-ся полисахариды – крахмал, целлюлоза), выделяется азот.
Помимо этих в-в, мкÒ необходимы доп в-ва – факторы роста, к ним относится большое кол-во АК, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины. Они входят в состав микробной #, но синтезировать их самостоятельно они не могут, поэтому факторы роста обязательно должны присутствовать в пит среде у некоторых б!!. Если мкÒ нуждаются в факторах роста – АУКСОТРОФЫ, если нет – ПРОТОТРОФЫ.
Источником N и S для мкÒ служат сульфаты, нитраты, карбонаты и др, к/е восстанавливаются до H2S и N2. Самый распространённый источник N –аммонийные соли (восстанавливаются до N2); т/же АК. Источником S явл H2S (в прир усл из него восст-ся S с участием Beggiatoa) и АК, содержащие S.
Осн преградой на пути пит в-в явл # мбна. Ч/з неё могут переноситься только те в-ва, для к/х есть спец транспортная система. Существует несколько типов транспорта веществ:
ПРОСТ ДИФФУЗИЯ – неспецифич проникновение в-в в #, зависит от размеров и липофильности молеклы.
ОБЛЕГЧЁННАЯ ДИФ-Я – по градиенту конц (без затрат эн) с помощью ферментов СУБСТРАТСПЕЦИФИЧНЫХ ПЕРМЕАЗ или ТРАНСЛОКАЗ.
АКТИВНЫЙ ТРАНСПОРТ – с затратой энергии и при участии спец ферментов, против градиента конц.
ТРАНСЛОКАЦИЯ ГРУПП – происходит перенос и трансформация молекулы: глюкоза → глюкозо-6-фосфат.
КЛСФ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД:
По консистенции:
Жидкие (МПБ, желчный и сахарный бульоны, пептонная вода …)
Полужидкие (полужидкий агар…)
Плотные (МПА, свёрнутая сыворотка крови …)
Сухие (Левина, Плоскирева…)
По происхождению:
Искусственные: а) животные (МПА, МПБ, МПЖ)
б) растительные (настои сена, отвары злаков, дрожжей, фруктов…)
Естественные: а) животные (кровь, сыворотка, жёлчь)
б) растительные (кусочки овощей или фруктов)
По составу:
Простые (МПА, МПБ)
Сложные (кровяные, сахарные, сывороточные питательные среды…)
По назначению:
Среды консервирования (для первичного посева и транспортировки) – предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов: гипертонический р-р, глицериновая смесь…
Среды обогащения – для накопления опред группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних и неблаг для др видов: селенитовая среда, пептонная щелочная вода, солевой и жёлчный бульоны…)
Элективные, селективные среды – для отдельных видов, готовятся с учётом биохимических и энергетических потребностей мкÒ. Выделяют кровяные и сывороточные (Борде–Жангу), яичные (Левенштайна–Йенсена, ЖСА…) и др. среды (ЖСА, УКА, Эндо, Плоскирева…).
Дифференциально-диагностические среды – для изучения и идентификации отдельных групп, видов, типов б!! В основе различные в-ва, при расщеплении к/х происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки, мочевина…) сторону. В них часто вносят индикаторы → визуально оценить изменение рН. Напр, сдвиг в КИСЛУЮ сторону вызывает покраснение индикатора Андреде (в основе фуксин) или пожелтение при использовании бромтимолового синего, а при сдвиге в ЩЕЛОЧНУЮ сторону они не меняют окраски.
Для выделения чистых культур применяют оптимальные питательные среды с фиксированным рН. Большинство б! способны расти на разл пит средах, за исключением хламидий и риккетсий, к/е не растут вне ##.
Дифференциально-диагностические среды используются для изучения и идентификации отдельных групп, видов, типов б!!. В их основе различные органические и неорг в-ва, при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки, мочевина…) сторону. В эти среды часто вносят разл индикаторы, позволяющих визуально оценить изменение рН. Напр, сдвиг в КИСЛУЮ сторону вызывает покраснение индикатора Андреде (в основе фуксин) или пожелтение при использовании бромтимолового синего, а при сдвиге в ЩЕЛОЧНУЮ сторону они не меняют окраски.
Дифф.-диагн. среды Эндо, Левина, Плоскирева прм для диагностики кишечных заболеваний (шигеллёзов, сальмонеллёзов). Готовятся они в чашках Петри, в основе МПА + лактоза (ферментируется только E.coli, но не патогенными мкÒ) + индикатор.
ЭНДО. Индикатор по типу индикатора Андреде, лучше держать в тёмном месте. Растущая колония E.coli вырабатывает конечные продукты → окраска красная, часто с металлическим блеском; Shigella и Salmonella → бесцветные колонии.
ЛЕВИНА. Индикатор - эозин-метилениовая синь, при рН ³ 7 имеет цвет эозина (розовый), в кислой среде – восстанавливается метиленовый синий (цвет тёмно-синий). Колнии E.coli → окраска тёмно-синяя, Shigella и Salmonella → бесцветные колонии (под цвет среды).
ПЛОСКИРЕВА. Индикатор – нейтральный красный; рН=7 бесцветный (патогенный б!), рН<7 розово-красный (E.coli). И ещё присутствуют 2 добавки: бриллиантовый зелёный и соли жёлчных кислот. На т/й среде угнетается рост воздушной мкФ, к тому же на ней не растут многие (но не все) штаммы E.coli.
РЕССЕЛЯ. Эта среда комбинированная, готовится в пробирке, половина –скошенная часть, другая – столбик. В среду входят МПА (среда полужидкая), лактоза (1%), глюкоза (0,1%), индикаторы (розоловая к-та и водно-голубой). При рН=7 среда окрашивается в розовый цвет (за счёт розоловой к-ты), рН<7 – в синий. Иногда добавляют бром-тимоловый синий, рН=7 – сине-зеленовытый, рН<7 – бесцветный. Рассев производят по поверхности скошенной части и уколом в глубину столбика. E.coli → среда обсцвечивается и появляются пузыри газа, Shigella и Salmonella → цв изм-ся только в столбике, а скошенная часть останется без изменений, т.к. наилучшие условия для ферментации глюкозы – анаэробные, наиболее активно она будет распадаться в столбике, образуя кисл продукты, газа не будет. У Salmonella paratyphi → то же плюс газ.
Также с дифф-диагн. целью используют другие ферментативные свойства. Напр, «пёстрый» (цветной) РЯД ГИССА – пептонная вода и различные углеводы + индикатор (Андреде = кислый фуксин + щёлочь) и стеклянный поплавок для улавливания газа. Из углеводов наиболее часто применяют моносахариды (глюкоза, ксилоза, арабиноза, фруктоза, манноза, галактоза), дисахариды (сахароза, мальтоза, лактоза), полисахариды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин) и гликозиды. Среды засевают, и если мкÒ имеет соответствующий фермент, то образуются кислоты, они восстанавливают фуксин и среда приобретает красный цвет. Если при окислении углеводов выделяется СО2, то он скапливается в поплавке. Белки расщепляются протеолитическими ферментами до АК, а они в свою очередь распадаются до простых соед-й (СО2, NН3 и др). На практике для определения этих ферментов опред-ют индол (+щавелевая кислота → краснеет) и сероводород (H2S) (+ уксусно-кислый Pb → чернеет).
Также определяют наличие плазмокоагулазы (по свёртыванию плазмы крови), гиалуронидазы (по р-рению сгустка гиалуроновой кислоты в пробирке в жидкой среде), лецитиназы (лецитин входит в состав # стенок, при добавлении в среду и его разрушении – ЖСА – скапливаются продукты обмена Þ помутнение; этот фермент есть у Staphylococcus aureus, а у St. epidermidis – нет).
21. Типы дыхания микроорганизмов. Методы создания анаэробных условий для культивирования. Основные принципы культивирования.
В процессе обмена в-в мкÒ постоянно нуждаются в притоке энергии. Она освобождается при ок-ии пит в-в и в виде АТФ исп-ся клеткой. Сущность ок-я закл-ся в переносе электронов и протонов от донора к акцептору. У мкÒ чаще происходит отщепление 2 атомов Н (дегидрирование) от акцептора при участии ДГ. Биол ок-е может проходить как при участии О2, так и без него. По отношению к О2 выделяют следующие группы мкÒ:
1) ОБЛИГАТНЫЕ АЭРОБЫ. Способны плч энергию путём дыхания. Причём обязательно нуждаются в О2, который используют в качестве конечного акцептора водорода.
2) ОБЛИГАТНЫЕ АНАЭРОБЫ. Процессы биол ок-я протекают у них по типу брожения, а расти и размножаться они могут только в бескислородных условиях, в присутствии О2 гибнут. Конечным акцептором водорода являются орг соед-я – чаще всего восстанавливается ПВК.
3) ФАКУЛЬТАТИВНЫЕ АНАЭРОБЫ. Могут расти и размножаться и в присутствии и в отсутствии О2, т.к. их ферментная система способна переключаться с одного типа дыхания на другой.
4) МИКРОАЭРОФИЛЫ. Лучше растут при низком содержании О2 и повышенном СО2 («капнофильные мкÒ»).
5) АЭРОТОЛЕРАНТНЫЕ. Могут выживать в присутствии атмосферного кислорода, но не могут использовать его в качестве конечного акцептора водорода (например, молочнокислые бактерии – бродильный метаболизм).
Т.о, факультативные анаэробы выращивают при пониженном содержании кислорода, облигатные – при полном его отсутствии, что достигается путем посева материалов внутрь жидкой или полутвердой питательной среды.
Условия культивирования. Наиболее пригодной для выращивания бактерий–анаэробов является среда Китта–Тароцци (среда обогащения), состоящая из концентрированного МПБ, глюкозы и агара. На дно пробирки для адсорбции кислорода помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1,0–1,5 см и заливают 6–7 мл среды. Перед посевом среду кипятят 10–15 мин для удаления воздуха, затем быстро охлаждают, а после посева заливают стерильным вазелиновым маслом. Материал, содержащий спороносные анаэробы, высевают в две пробирки со средой Китта–Тароцци, одну из них прогревают 30 мин при температуре 80°С для уничтожения вегетативных форм сопутствующей микрофлоры.
Посевы на поверхности плотных сред, разлитых в чашки Петри, культивируют в макро– или микроанаэростате.
Макроанаэростат представляет собой двухстенный аппарат с крышкой. Между стенками аппарата находится вода, источником тепла служит электричество, терморегулятор обеспечивает постоянную температуру. Посевы помещают в анаэростат после того, как температура в нем будет доведена до 37°С, и герметически закрывают крышкой. Анаэростат соединяют с вакуум–насосом и, выкачивая воздух, создают вакуум 3–5 мм. Посевы инкубируют в анаэростате обычно в течение 48 ч. Имеются также портативные анаэростаты. Это небольшие металлические цилиндры с герметически закрывающейся крышкой, постоянная температура в которых создается при помещении их в термостат.
Особенности выделения бактерий–анаэробов. В первый день исследуемый материал микроскопируют и высевают в среду Китта–Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой, прогревают при температуре 80°С в течение 30 мин, заливают вазелиновым маслом и посевы помещают в термостат. На второй день помутневшую (нередко вспенившуюся) среду обогащения набирают пастеровской пипеткой, которую опускают через слой вазелинового масла до дна пробирки.
Выделенную культуру микроскопируют и пересевают на плотные питательные среды. Изолированные колонии получают последовательным засевом шпателем бульонной культуры в три чашки Петри с кровяно–сахарным агаром. Чашки Петри помещают в анаэростат при температуре 37°С на 24–48 ч или культуру засевают в столбики расплавленных и остуженных сахарных агаров после предварительного разведения в изотоническом растворе натрия хлорида. На третьи сутки изучают выросшие на чашках Петри колонии (или извлекают колонии из столбиков агара), делают из них мазки, высевают на среду Китта–Тароцци для обогащения чистой культуры.
Чтобы установить видовую принадлежность выделенной культуры бактерий, кроме изучения морфологических, тинкториальных и культуральных особенностей, необходимо определить на ряде Гисса их ферментативные свойства.
Т.о, используют следующие методы получения анаэробных условий:
- ФИЗИЧЕСКИЙ (анаэростат)
- ХИМИЧЕСКИЙ (оксикатор, сорбент – пирогаллол)
- БИОЛОГИЧЕСКИЙ
- Метод ФОРТНЕРА – чашку петри пополам, заливают парафином
- Метод ЧАСОВЫХ СТЁКОЛ – выпуклое засевают аэробами.
- с использованием спец. пит. сред
- уколом в среду ВИЛЬСОН–БЛЕРА (колонии чёрные)
- в стеклянной трубке.
22. Рост и размножение микроорганизмов. Периодические и непрерывные культуры.
Рост клеток – координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки.
Размножение клеток – увеличение числа клеток. Происходит либо путем поперечного деления, возникающего в процессе роста, либо, что встречается реже, почкованием, либо путем образования спор. Большинство прокариотов (в т.ч. спирохеты и риккетсии) размножается поперечным делением. Актиномицетфы размножаются путем фрагментации нитевидных клеток с образованием палочковидных и кокковидных клеток. Представители сем. Streptomycetaceae образуют воздушные гифы, от которых отшнуровываются споры, служащие для размножения. Хламидии проходят при размножении определенный цикл (элементарные и ретикулиновые тельца), чем отличаются от других прокариотов.
23. Классификация, структура и особенности биологии вирусов.
В! – не облад собственным обменом в-в Þ нуждается в живой #. Причём, чем моложе # и чем интенсивнее протекают в ней обменные процессы, тем лучше и быстрее репродуцируется В! (эмбриональные, раковые ##).
Классификация и морфология:
в зависимости от #-хозяина: р!, ж!, б!, чка.
от локализации в #: в цтпл, в яд.
от типа НК: ДНК– и РНК–овые.
от строения: простые, сложные
ПРОСТЫЕ В! состоят из НК, покрытой белковой оболочкой (КАПСИД), к/я защищает НК от разл воздействий. Она состоит из отдельных субъединиц (КАПСОМЕРОВ), их кол-во разл у разн В!!.
СЛОЖНЫЕ – т/же им НК, капсид, СУПЕРКАПСИДНАЯ ОБОЛОЧКА, в состав которой кроме белка входят липиды и углеводы. У нек сложных в!! на поверхности есть выросты – нейраминидазы и гемагглютинины (вирус гриппа).
Особенность биологии вирусов: это облигатные внутриклеточные паразиты.
24. Основные этапы и исходы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.
Взаимодействие с # хозяина:
АДСОРБЦИЯ в! на поверхности #. Она м.б. обратимой и необратимой. При приближении в! к #, происходит взаимодействие его специфических рецепторов с комплементарными структурами #. Если взаимодействие по типу хим реакции – НЕОБРАТИМОЕ, если слабое взд – ОБРАТИМОЕ.
ПРОНИКНОВЕНИЕ в! в #. Некоторые в!! (бактериофаги) вводят только НК, другие – полностью проникают в # со всеми своими оболочками.
«РАЗДЕВАНИЕ». Собственные ферменты #, принимая в! за чужеродное в-во, начинают расщеплять оболочки, помогая ему освободить свою НК.
НК в! БЛОКИРУЕТ ГЕНОМ # ХОЗЯИНА, выключает его из работы и берёт управление всеми БХ процессами под свой контроль. # перестаёт выполнять свою работу и начинает производить новые в! частицы, причём на рибосомах синтезируются капсомеры, в ядре (или цтпл) ген материал.
САМОСБОРКА ВИРУСА.
ВЫХОД В!. Если вирус простой, то покидает # взрывоподобно, все в! частицы выходят одновременно, а # ЛИЗИРУЕТСЯ. Если сложный – то выходит плавно, отпочковываясь, достраивая при этом суперкапсид. # не погибает, какое-то время она сохраняет свою жизнеспособность, но в полной мере выполнять свои функции уже не может. Т/е больные клетки округляются, сливаются в многоядерный синцитий…
Т.о., в результате взаимодействия ИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА с # она либо погибает, либо остаётся живой, но больной.
НЕИНФЕКЦИОННЫЕ ВИРУСЫ проходят те же стадии, но их НК не блокирует, а встраивается в геном #, мирно с ней сосуществует и ни чем себя не проявляет. Материнская # делится, а генетический материал вируса попадает в дочерние ##. Т/е в!! называются ЛАТЕНТНЫМИ (или СКРЫТОЙ ИНФЕКЦИЕЙ), т.е. происходит персистенция в!. Активизация начинается обычно при ослаблении организма, НК выходит из генома и начинает вести себя как вирулентный инфекционный вирус. Интегрированный с клеточным геномом хозяина вирус наз ПРОВИРУСОМ, а процесс объединения в! с хр (НК) наз-ся ВИРОГЕНИЯ.
Исходы взаимодействия вируса с клеткой:
гибель или болезнь хозяина
персистирование, затем в! может активироваться или # станет опухолевой.
Абортивный исход. Вирус проникает в #, но погибает и дальнейшего процесса не происходит.
25. Основные методы культивирования вирусов. Клеточные культуры, их типы, способы выявления вирусов в клеточных культурах.
Впервые ## культуры были использованы в 50-х гг. Клетки клсф-ся на:
1) ПЕРВИЧНО ТРИПСИНИЗИРОВАННЫЕ. Их получают из эмбриональной тк чка, обезьян и т.д. Тк помещают в спец пит среду, освобождают от разл ненужных эл-тов, измельчают, а затем заливают р-ром трипсина в сосуде. Помещают на магнитную мешалку, сосуд встряхивается, а трипсин разрушает меж# связи Þ ## разъединяются. Затем проводят центрифугирование: живые ## оседают, а мёртвые – всплывают. Надосадочную жидкость с мёртвыми ## сливают, осадок заливают пит средой, взбалтывают и получают взвесь, а затем подсчитывают кол-во ## в камере Горяева. Взвеси помещают в разл ёмкости и добавляют спец ростковую среду, прчём на 1 мл пит среды должо быть ³ 2 млн #. Они крепятся к поверхности стекла, омываются средой и начинают размножаться, покрывая пов сосуда МОНОСЛОЕМ. Затем ростковую среду сливают и добавляют поддерживающую (## не погибают, но и не размножаются) и ВИРУСЫ и культивируют 3-4 суток. По св составу поддерживающие среды должны приближаться к тк жидкости МКÒ. В их основе лежит солевой р-р Хэнкса, содержащий в необх конц мин соли. К нему добавляют АК, витамины, пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, углеводы и индикатор (метиловый красный). При рН=7 цв КРАСНЫЙ (## неживые), при сдвиге в кислую сторону – ЖЕЛТЕЕТ (если ## живые, то выделяются кислые продукты их жизнедеятельности). При накоплении большого кол-вапродуктов обмена, нужно менять среду.
Если к поддерживающей среде добавить СЫВОРОТКУ КРОВИ, в к/й содержится спец белок ПЕТУИН, стимулирующий размножение (чаще всего исп сыв эмбрионов КРС), то получают ростковую среду.
Первично трипсинизированные культуры используются ТОЛЬКО 1 РАЗ.
2) ПОЛУПЕРЕВИВАЕМЫЕ КЛЕТКИ. Их можно перевивать 50-100 раз. В основном это диплоидные ##.
3) ПЕРЕВИВАЕМЫЕ (БЕССМЕРТНЫЕ) – это раковые клетки: Hela, Hep-1, Hep-2 – были получены в 50-х гг, затем их постоянно пересеивали. В этом случае из старой пробирки выливают пит среду и добавляют ВЕРСЕН, под его влиянием ## отлипают. Взвесь клеток с этим в-вом центрифугируют, ## оседают, версен сливают и добавляют поддерживающий пит раствор. Т.о., снова получают готовую культуру.
Вирусы в клеточной культуре выявляют по их цитопатическому действию:
1) по образованию ими на среде сплошного (газонного) роста бесклеточных "бляшек"
2) по вакуолизации клеток культуры
3) появлению клеточных включений
Также используются электронная микроскопия и серологические реакции.
26. Бактериофаги. Морфология, взаимодействие с клеткой, культивирование, практическое использование.
Бактериофаги (греч. phagos – пожирающий) – это в!!, паразитирующие на б!!, были открыты 1917 г. В настоящее время, кроме бактериофагов, известны фаги микоплазм, грибов, дрожжей, синезеленых водорослей.
Строение и химический состав фагов. Как в! имеет очень малые размеры, примерно 100-200 нм. Различают простые и сложные, РНК– и ДНК–содержащие фаги. Простые РНК–фаги имеют круглую или нитевидную форму. Наиболее хорошо изученные сложные фаги эшерихий имеют вид барабанной палочки с шестигранной головкой, в которой находится ДНК. Имеют отростки, к/е состоят из полого стержня, снаружи покрытого сократительным чехлом. На дистальном конце отростка находится шестиугольная базальная пластинка с шестью отходящими от нее нитями–рецепторами.
Фазы взаимодействия фага с бактериями. При эффективном взаимодействии сложный фаг эшерихий адсорбируется на бактериях дистальным концом отростка. При этом из–под его базальной пластинки выделяется лизоцим, который вызывает образование в оболочке эшерихий отверстия. Вслед за этим происходит сокращение головки и чехла фаговой частицы, проникновение через цитоплазматическую мембрану кончика его стержня и выход в цитоплазму фаговой ДНК. После ее введения следует фаза смены информации и последующий синтез ДНК и белка фага. На заключительном этапе взаимодействия фага с бактерией происходит самосборка фаговых частиц.
Следствие взаимодействия фага с бактерией. Полный цикл развития фагов продолжается до 1,5ч, в течение которых образуется 100–200 фаговых частиц, что заканчивается лизисом бактерий под влиянием фагового лизоцима. Фаги, обусловливающие лизис микробов и формирование новых фаговых корпускул, называются вирулентными. Наряду с вирулентными в природе имеются умеренные фаги, их взаимодействие с бактериями проявляется в двух формах: одни штаммы или клетки определенного вида бактерий они разрушают, в другие проникают, но гибели не вызывают. В последнем случае геном умеренного фага интегрирует в геном бактерии и в дальнейшем воспроизводится вместе с ним при делении #. Умеренный фаг, наследственные детерминанты к/го объединились с бактериальными, называются профагом; бактерии, содержащие профаг, – лизогенными, а само явление– лизогенией.
Связь профага с бактерией очень прочная и в естественных условиях нарушается оч редко (спонтанная продукция фага). Частоту отщепления профага от бактериальной хромосомы можно увеличить, воздействуя на лизогенные бактерии ультрафиолетовыми лучами, ионизирующей радиацией, магнитным полем и химическими мутагенами (индукция лизогенных бактерий).
Выявление. Как и в!! животных, фаги обнаруживаются под электронным микроскопом и по эффекту их действия на чувствительные микробы. При этом, размножаясь в бульонных культурах, они вызывают просветление среды, а на агаровых газонах подавляют рост бактерий в местах их внесения или формируют колонии в виде мелких стерильных (негативных) пятен – бляшек фага. Подобно колониям бактерий, морфология бляшек специфична для различных фагов. Вирулентные фаги обычно образуют прозрачные бляшки, а умеренные – мутные.
Распространение. Фаги обнаруживаются во всех объектах окружающей среды, в которых обитают бактерии, актиномицеты, грибы, микоплазмы. Найдены они в воде, почве, молоке, в различных выделениях человека и животных.
Получение и практическое применение. Фаги получают путем фильтрации и очистки лизированных ими бульонных культур бактерий. Готовый препарат фага представляет собой прозрачную желтоватую жидкость. В целях повышения стабильности фильтрат фаголизатов таблетируют.
Используются фаги главным образом для ИДЕНТИФИКАЦИИ И ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ. Для этого применяют наборы типоспецифических фагов, лизирующих определенные варианты бактерий. Особую ценность метод фаготипирования приобретает при эпидемиологическом обследовании очага, где с его помощью удается выявить источники и пути передачи инфекции.
Узкоспецифический спектр действия фагов ограничивает широкую возможность их использования как ЭТИОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ. Для лечения в основном применяют стафилококковый и стрептококковый бактериофаги и колибактериофаг. Они представляют собой фильтраты фаголизатов соответствующих бактерий, их выпускают в запаянных ампулах или флаконах. Эти препараты назначают при нагноительных процессах, вызванных фагочувствительными штаммами стафилококка, стрептококка и кишечной палочки, орошая ими инфицированную рану или обкалывая очаг воспаления.
В целях ПРОФИЛАКТИКИ фагирование в настоящее время проводят только в очагах брюшного тифа и дизентерии. Взрослые люди, находившиеся в контакте с больными, принимают указанные бактериофаги внутрь за 1,5–2 ч до еды по 1–2 таблетке (в дизентерийном очаге 2–3 раза с интервалом 3 дня).
27. Методы микроскопии в микробиологии. Их практическое применение.
Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0,2–20 мкм и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20–30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы.
В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.
Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые делятся на сухие и иммерсионные.
Сухие объективы с относительно большим фокусным расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10–20 мкм), иммерсионные (лат. immersio – погружение) с фокусным расстоянием – при исследовании более мелких микробов.
При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты. В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигает 1350.
При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив малого увеличения и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро–, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работы удаляют салфеткой масло с фронтальной линзы объектива.
Микроскопия в темном поле зрения проводится при боковом освещении и обычно применяется при изучении подвижности бактерий или обнаружении патогенных спирохет, поперечник которых может быть меньше 0,2 мкм. Чтобы получить яркое боковое освещение, обычный конденсор заменяют специальным параболоидом–конденсором, в котором центральная часть нижней линзы затемнена, а боковая поверхность зеркальная. Этот конденсор задерживает центральную часть параллельного пучка лучей, образуя темное поле зрения. Краевые лучи проходят через кольцевую щель, попадают на боковую зеркальную поверхность конденсора, отражаются от нее и концентрируются в его фокусе. Если на пути луча нет каких–либо частиц, он преломляется, падая на боковую зеркальную поверхность, отражается от нее и выходит из конденсора. Когда луч встречает на своем пути микробы, свет отражается от них и попадает в объектив – клетки ярко светятся. Так как для бокового освещения необходим параллельный пучок света, применяется только плоское зеркало микроскопа. Обычно исследование в темном поле зрения проводится под сухой системой. При этом небольшую каплю материала помещают на предметное стекло и накрывают покровным, не допуская образования пузырьков воздуха.
Фазово–контрастная и аноптральная микроскопия основаны на том, что оптическая длина пути света в любом веществе зависит от показателя преломления. Это свойство используют с целью увеличить контрастность изображения прозрачных объектов, какими являются микробы, т. е. для изучения деталей их внутреннего строения. Световые волны, проходя через оптически более плотные участки объекта, отстают по фазе от световых волн, не проходящих через них. При этом интенсивность света не меняется, а только изменяется фаза колебания, не улавливаемая глазом и фотопластинкой. Для повышения контрастности изображения фазовые колебания при помощи специальной оптической системы превращаются в амплитудные, хорошо улавливаемые глазом. Препараты в световом поле зрения становятся более контрастными – положительный контраст; при отрицательном фазовом контрасте на темном фоне виден светлый объект. Вокруг изображений нередко возникает ореол.
Большей четкости изображения малоконтрастных живых микробов (даже некоторых вирусов) достигают в аноптральном микроскопе. Одной из важнейших его деталей является линза объектива, расположенная вблизи «выходного» зрачка, на которую нанесен слой копоти или меди, поглощающий не менее 10 % света. Благодаря этому фон поля зрения приобретает коричневый цвет, микроскопируемые объекты имеют различные оттенки – от белого до золотисто–коричневого.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых клеток и красителей светиться при попадании на них ультрафиолетовых и других коротковолновых лучей света. Люминесцентные микроскопы представляют собой обычные световые микроскопы, снабженные ярким источником света и набором светофильтров, которые выделяют коротковолновую часть спектра, возбуждающую люминесценцию. Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливают сине–фиолетовый светофильтр (УФС–3, ФС–1 и пр.). На окуляр надевают желтый светофильтр (ЖС–3 или ЖС–18).
Различают собственную (первичную) флюоресценцию и наведенную (вторичную). Так как большая часть микробов не обладает собственной флюоресценцией, они обрабатываются красителями, способными флюоресцировать (вторичная люминесценция). В качестве флюорохромов используют аурамин (для обработки микобактерий туберкулеза), акридин желтый (гонококки), корифосфин (коринебактерии дифтерии), флюоресцеинизотиоцианат (для мечения антител).
Люминесцентная микроскопия отличается рядом преимуществ: дает цветное изображение и значительную контрастность; позволяет обнаружить живые и погибшие микроорганизмы, прозрачные и непрозрачные объекты; установить локализацию бактерий, вирусов и их антигенов в пораженных клетках организма.
Электронный микроскоп. В электронном микроскопе вместо света используется поток электронов в безвоздушной среде, на пути которых находится анод. Источником электронов является электронная пушка (вольфрамовая нить, разогреваемая до 2500–2900 °С). Оптические линзы заменены электромагнитами. Между вольфрамовой нитью и анодом возникает электрическое поле в 30 000–50 000 Вт, что сообщает электронам большую скорость, и они, проходя через отверстие анода, попадают в первую электромагнитную линзу (конденсор). Электронные лучи на выходе из конденсора собираются в плоскости исследуемого объекта. Они отклоняются под разными углами за счет различной толщины и плотности препарата и попадают в объективную электромагнитную линзу, снабженную диафрагмой. Электроны, незначительно отклонившиеся при встрече с объектом, проходят через диафрагму, а отклонившиеся под большим углом – задерживаются, благодаря чему обеспечивается контрастность изображения. Линза объектива дает промежуточное увеличение изображения, которое наблюдается через смотровое окно. Проекционная линза может увеличивать изображение во много раз. Это изображение принимается на флюоресцирующий экран и фотографируется. Разрешающая способность электронных микроскопов равна 1,0 –0,14нм
28. Понятие о гене и этапах развития генетической системы. Генетический аппарат бактерий.
Ген – стр.-функц. единица хромосомы, отвечающая за наличие и функционирование определенного белка в клетке (организме).
В бактериальной хромосоме выделяют ряд участков:
1) промотор – участок ДНК, распознаваемый ДНК-зависимой-РНК-полимеразой.
2) оператор – участок ДНК, промотором и структурным геном, с которым связывается белок-репрессор.
3) Оперон – содержит регуляторный ген, промоторный участок, область оператора и последовательность генов, регулируемых данным опероном. Он является функц.-генетической единицей.
Ген-регулятор кодирует белок-репрессор, связывающий оператор и индуктор. Нет индуктора – оперон "молчит", появляется индуктор – оперон "работает".
Белок-репрессор – распознает нуклеотидную последовательность ДНК.
(Lac-оперон – индуцибельный оперон, контролирующий синтез ферментов по обеспечению бакт. клетки лактозой).
Бактерии относятся к царству прокариот, отличаются от эукариот тем, что содержат 1 ХР, к/я представлена 2-хцепочечной ДНК, кольцевидной формы, в ней содержится вся наследственная информация (ГЕНОТИП). Она фиксируется на мезосоме, и при делении # мезосома перемещает нити ДНК в дочерние ##. Иногда этот процесс опережает деление самой клетки, тогда в 1 Б! может оказаться 2 хр. Хромосома б! не содержит ГИСТОНОВ, в # нет ЦЕНТРОМЕРОВ, делится только МИТОЗОМ. Также Б! отличаются РАЗМЕРАМИ.
В ДНК содержатся интроны (ИНФОРМАТИВНЫЕ) и экзоны (МОЛЧАЩИЕ УЧАСТКИ). У прокариот имеются особые гены, способные перемещаться вдоль ДНК и встраиваться в новые места. Это «прыгающие» гены – ТРАНСПОЗОНЫ (включают около 2 тыс пар НКт). Они обеспечивают устойчивость к антибиотикам, изменчивость и Мт (встраиваясь в новые места во время транскрипции, нарушают последовательность НКт). По обе стороны от транспозона расположены 2 одинаковые последовательности НКт (>800) – это IS–ЭЛЕМЕНТЫ (“ВСТАВОЧНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ”), к/е содержат гены, не контролирующие признаки бактерий, но встраиваясь в ДНК вместе с транспозонами или без них перестраивают геном → мутации.
В цтпл Б! м.б. доп АВТОНОМНЫЕ уч-ки ДНК, имеющие 2-хцепочечную структуру и пальцевидную форму, но в сотни раз < основной ДНК. Это ПЛАЗМИДЫ, в 1# их м.б. до 20 штук. Они не обязательны для жизни #, но и без них # нормально функционировать не может. Плазмиды обладают след св!!:
- Контролируют отдельные пр!! Б#
- Способны интегрировать с хромосомой # и выходить из её состава.
- Способны к транслокации, т.е. к самостоятельному перемещению из 1 # в др (ТРАНСМИССИВНЫЕ или КОНЪЮГАТИВНЫЕ плазмиды) или в составе хромосомы.
29. Внехромосомные материалы ДНК. Плазмиды, транспозоны, инсервационные последовательности. Роль плазмид в изменчивости бактерий, виды плазмид.
У прокариот имеются особые гены, способные перемещаться вдоль ДНК и встраиваться в новые места. Это «прыгающие» гены – ТРАНСПОЗОНЫ (включают около 2 тыс пар НКт). Они обеспечивают устойчивость к антибиотикам, изменчивость и Мт (встраиваясь в новые места во время транскрипции, нарушают последовательность НКт). По обе стороны от транспозона расположены 2 одинаковые последовательности НКт (>800) – это IS–ЭЛЕМЕНТЫ (“ВСТАВОЧНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ”), к/е содержат гены, не контролирующие признаки бактерий, но встраиваясь в ДНК вместе с транспозонами или без них перестраивают геном → мутации.
В цтпл Б! м.б. доп АВТОНОМНЫЕ уч-ки ДНК, имеющие 2-хцепочечную структуру и пальцевидную форму, но в сотни раз < основной ДНК. Это ПЛАЗМИДЫ, в 1# их м.б. до 20 штук. Они не обязательны для жизни #, но и без них # нормально функционировать не может. Плазмиды обладают след св!!:
- Контролируют отдельные пр!! Б#
- Способны интегрировать с хромосомой # и выходить из её состава.
- Способны к транслокации, т.е. к самостоятельному перемещению из 1 # в др (ТРАНСМИССИВНЫЕ или КОНЪЮГАТИВНЫЕ плазмиды) или в составе хромосомы.
Существует множество ВИДОВ плазмид, например:
R–плазимда – резистивные, состоят из 2 основных генов. Один отвечает за конъюгативные св!! плазмиды, др – за устойчивость к лек-вам (антибиотикам), чем больше генов, тем к большему числу препаратов устойчив мкÒ.
F–плазимда – фертильность (плодовитость). Она определяет пол Б#. Если она есть в #, то это F+ клетка (♂), если нет, то F– (♀). Эта плазимда может перемещаться из # в #, при этом если в F–, то она становится F+. F–плазимда контролирует образование на поверхности бактерии особых СЕКС–ПИЛЕЙ – полый трубочки, через которые при размножении перемещается генетический материал. Часто встраивается в основную хромосому клетки.
Col–плазимда – получила название от E.coli, у к/й они впервые были обнаружены. Контролирует выработку токсических белков – БАКТЕРИОЦИНОВ, применительно к разным видам бактерий имеют свои названия, например, E.coli – колицины. Бактериоцины губительно д-ют на др Б!! особенно в пределах семейства, что даёт селективное преимущество и позволяет расширять своё жизненное пространство.
Плазимды, контролирующие образование адгезинов – спец выростов, с пом к/х Б! крепится к поверхности # (особенно важно при колонизации слизистых оболочек), это м.б. ПИЛИ АДГЕЗИИ млм др структуры.
Ent–плазимда – содержит информацию об ЭНТЕРОТОКСИНАХ, вызывающих диаррейные состояния, т.к. токсичны для ## слизистой ЖКТ.
Hly–плазимда – информация о синтезе ГЕМОЛИЗИНОВ – это токсины, способные разрушать мембрану эритроцитов и вызывать гемолиз. С их помощью мкÒ получает Fe, необходимое для жизнедеятельности.
Vir–плазимда – ВИРУЛЕНТНОСТЬ.
В качестве плазмид рассматривается и геном бактериофага, если он располагается автономно в цитоплазме, а не встроен в хромосому.
30. Понятие о генотипе и фенотипе. Модификационная и генотипическая изменчивость бактерий.
Генотип – совокупность всех генов, присущих данному организму, т.е. его генетическая конституция.
Фенотип – внешнее, видимое проявление генотипа, обусловленное им и воздействием окружающей среды.
ИЗМЕНЧИВОСТЬ – совокупность различий по признаку м/у ÒÒ одного вида или популяции.
Фенотипические изменения – МОДИФИКАЦИЯМИ, при этом изменений ДНК не происходит, и вскоре они утрачиваются. Модификации возникают в ответ на изменение условий окр среды и позволяют мкÒ быстро адаптироваться и сохранять свою жизнеспособность. Проявляются в изменении морфологических, БХ и других признаков, после устранения действия фактора, происходит реверсия.
В основе – индукция и репрессия соответствующих генов (например, E.coli только в присутствии лактозы синтезирует необходимые ферменты, стафилококки – в присутствии пенициллина синтезируют разрушающий его фермент).
К модификациям можно отнести включение «МОЛЧАЩИХ» ГЕНОВ, в результате чего происходит смена их антигенов в ходе инфекционного заболевания.
Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, при этом образуются L-формы, лишенные # стенки. Они могут сохраняться и даже размножаться внутри ## хозяина, после прекращения действия антибиотика вновь реверсировать к исходной форме.
МУТАЦИИ – изменения в структуре ДНК, закрепляются и прередаются по наследству. Классифицируют по происхождению, характеру изменений в структуре ДНК, фенотипическим последствиям и др.
По ПРОИСХОЖДЕНИЮ мутации подразделяют на:
спонтанные – составляют естественный фон. Они появляются под влиянием разных причин: ОШИБКИ в репарирации или репликации ДНК, ошибочное включения в дочернюю цепь НЕКОМПЛЕМЕНТАРНОГО АО (А=Т, Г≡Ц), ИНСЕРТАЦИОННЫЕ мутации (insertion – вставка, возникают при встраивании в хромосому микробной # Is-последовательностей, транспозонов и плазмид, при наличии ГЕНОВ-МУТАТОРОВ частота мутаций увеличивается в >100 раз).
индуцированные – получают под влиянием мутагенов.
По КОЛИЧЕСТВУ МУТИРОВАВШИХ ГЕНОВ:
ГЕННЫЕ – затрагивают один ген, чаще всего – точковые,
Точковые – замену или вставку пары АО в ДНК → изменение 1 кодона Þ вместо одной АК кодируется другая или нонсенскодон (нонсенсмутация) – это ПРЯМАЯ Мт. Впоследствии может возникнуть вторичная (ОБРАТНАЯ) мутация в этом же гене → восстановление дикого генотипа и фенотипа.
Вставка или выпадение одной пары АО → изменение всех последующих кодонов в пределах 1 гена (Мт со сдвигом считывания).
хромосомные – распространяются на несколько генов, возникают в результате выпадения нуклеотидов (ДЕЛЕЦИЯ), поворота участка ДНК на 180° (ИНВЕРСИЯ), повторения фрагмента ДНК (ДУПЛИКАЦИЯ). Один из механизмов связан с перемещением Is-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ и ТРАНСПОЗОНОВ из одного участка ДНК в другой или из хромосомы в плазмиду и наоборот → нарушается функция гена.
По ФЕНОТИПИЧЕСКИМ ПОСЛЕДСТВИЯМ:
Нейтральные –фенотипически не проявляются.
Условно-летальные – приводят к изменению функциональной активности фермента. В зависимости от условий окр среды мкÒ могут сохранять свою жизнеспособность или утрачивать ее. Так, например, ts-мутанты (температурочувствительные) могут синтезировать ферменты, активные при 37°С, но неактивные при 42 °С, у Б!! дикого типа – активны при обеих t°C.
Летальные – характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важные ферменты (особенно ДНК-полимераз).
Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и БХ признаков: жгутиков, пилей, капсулы, # стенки; способности ферментировать углеводы, синтезировать опред АК, витамины и другие соединения, устойчивость к лекарствам или дезинфектантам и т. д. Þ ауксотрофы, растут только в среде с готовым продуктом.
Действие мутации на трансляцию:
1. Бессмысленные (missens) мутации
2. Frame-shift мутации – со сдвигом считывания и изменением всех последующих кодонов.
3. Супрессорные – восстан. функции генов, инактив-ых предыдущей мутацией
4. Мутации на клеточном уровне – можно выявить, если вызывает фенотипические изменения
5. Мутации с приобретением (способности синтезировать активный фермент), лаг-фазам между мутацией и синтезом фермента отсутствует.
6. Мутации с утратой – вызывает прекращение синтеза к.-л. фермента, а клетка сохраняет функц. активность. Если рост клетки продолжается, то кол-во фермента умен-ся с каждым делением в 2 раза.
7. Изменения в виде трансдукции, трансформации, коньюгации.
31. Генетические рекомбинации (трансдукция, конъюгация, трансформация).
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМБИНАЦИИ у эукариот совершаются в процессе полового размножения путем взаимного обмена фрагментами хромосом, при этом из двух родительских хромосом образуются две рекомбинантные, т.е. возникают две рекомбинантные особи.
У прокариотов нет полового размножения Þ в результате внутригеномных перестроек: изменение локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в # реципиента части ДНК донора → формирование мерозиготы, т.е. образуется только ОДИН РЕКОМБИНАТ.
ГенР происходят при участии ферментов в пределах отдельных генов или групп сцеплений генов. Существуют специальные REC–ГЕНЫ, определяющие способность бактерий к рекомбинациям. Передача генетического материала от Б! к Б! происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации, а плазмидных генов - путем трансдукции и конъюгации.
ТРАНСФОРМАЦИЯ – непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора Рец#. (Впервые Гриффитс – опыт с живым авирулентным бескапсульным штаммом пневмококка, к/й стал вирулентным при обработке экстрактом убитых капсульных пневмококков.)
С донорной ДНК в реципиентную клетку обычно передается только один ген, т.к. фрагмент ДНК, который может проникнуть в Рец# очень маленький. Трансформации поддаётся только часть клеток Б!! популяции – КОМПЕТЕНТНЫМИ. Состояние компетентности (когда стенка Б! проницаема для высокополимерных (Мг=0,5–1 млн) фрагментов ДНК) возникает обычно в конце LOG–ФАЗЫ.
Фазы процесса трансформации:
адсорбция ДНК-донора на Рец#;
проникновение ДНК внутрь Рец# и деспирализация ДНК.
соединение любой из двух нитей ДНК донора с гомологичным участком хромосомы реципиента и последующая рекомбинацией.
Эффективность зависит от СТЕПЕНИ ГОМОЛОГИЧНОСТИ ДНК донора и реципиента, что определяет конечный результат, т. е. количество формирующихся рекомбинантов (трансформантов) Þ межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.
ТРАНСДУКЦИЯ – передача генетического материала с помощью фагов. Различают три типа трансдукции:
Неспецифическая (общая). В момент сборки фаговых частиц в их головку может проникнуть ЛЮБОЙ фрагмент ДНК Б!–донора. Вместе с фаговой ДНК переносятся любые гены донора и включаются в гомологичную область ДНК Рец# путем рекомбинации. Фаги только переносят генетического материала
Специфическая – фаг переносит ОПРЕДЕЛЕННЫЕ гены при выщеплении профага из Б! хромосомы вместе с рядом расположенными генами, при этом фаг становится дефектным. При взаимодействии фага с Рец# происходит включение гена донора и дефектного фага в хромосому РецБ!, а Б!! становятся невосприимчивыми к последующему заражению вирулентным фагом.
Абортивная – фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому РецБ!, а располагается в цитоплазме и в таком виде функционирует. Во время деления этот фрагмент ДНК передаётся только одной дочерней #, и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.
КОНЪЮГАЦИЯ – перенос генетического материала из клетки-донора в клетку реципиента при их СКРЕЩИВАНИИ. Доноры – ## с F-плазмидой (половой фактор). При скрещивании F+ с F– # половой фактор передается независимо от хромосомы донора, при этом почти все Рец# становятся F+.
F-плазмида может интегрировать в Б! хромосому. В некоторых случаях она освобождается, захватывая при этом сцепленные с ней Б! гены (обозначаются с указанием включенного гена: F-lac).
ЭТАПЫ:
прикрепление клетки-донора к Рец# с помощью SEX-ПИЛЕЙ
образование конъюгационного МОСТИКА, через который передаётся F-фактор и другие плазмиды, находящиеся в цитоплазме донора.
разрыв одной из цепей ДНК (в месте включения F-плазмиды) при участии эндонуклеазы. Один конец ДНК проникает в Рец# и сразу же достраивается до 2-нитевой структуры. При переносе захватывается часть ДНК Б!-донора – Hfr-штаммы (HIGH FREQUENCY OF RECOMBINATION). При скрещивании Hfr-штамма с F–# F-фактор, не передается (т.к. конъюгационный мостик разрывается, а F-фактор расположен в дистальной части хромосомы). Передаются только гены Б! хромосомы, расположенные вблизи начала переноса (О–точка (origin)).
На ОСТАВШЕЙСЯ в # нити ДНК синтезируется 2 цепочка.
32. Генетика вирусов.
Геном вируса представлен РНК либо ДНК, одно- или двунитчатой.
Единица мутации – мутон – замена элемента генома, что ведет к измен. свойств вируса. Может быть вставка или делеция нуклеотидов.
По ПРОИСХОЖДЕНИЮ мутации подразделяют на:
- спонтанные – составляют естественный фон. Они появляются под влиянием разных причин: ошибки в репарации или репликации днк, ошибочное включения в дочернюю цепь некомплементарного ао (а=т, г≡ц), инсертационные мутации (insertion – вставка, возникают при встраивании в хромосому микробной # is-последовательностей, транспозонов и плазмид, при наличии генов-мутаторов частота мутаций увеличивается в >100 раз).
- индуцированные – получают под влиянием мутагенов.
По КОЛИЧЕСТВУ МУТИРОВАВШИХ ГЕНОВ:
Генные – затрагивают один ген, чаще всего – точковые,
а) Точковые – замену или вставку пары нуклеотида в ДНК → изменение 1 кодона Þ вместо одной АК кодируется другая или нонсенскодон (нонсенсмутация) – это ПРЯМАЯ Мт. Впоследствии может возникнуть вторичная (ОБРАТНАЯ) мутация в этом же гене → восстановление дикого генотипа и фенотипа.
Множественные (геномные).
По ФЕНОТИПИЧЕСКИМ ПОСЛЕДСТВИЯМ:
Нейтральные –фенотипически не проявляются.
Проявл. фенотипически.
Виды мутантов:
1. по морфологии бляшек (напр., аденовирусы с большими бляшками быстрее высвобождаются из клеток по сравнению с диким типом.
2. Мутанты по типу хозяев
3. Термочувствительные мутанты – могут размножаться только при пониженной температуре.
4. Холодочувствительные мутанты.
5. Делеционные мутанты – теряют важные участки генома и требуют для своего размножения присутствия вируса-помощника.
6. Прочие: устойчивые к ингибиторам, устойчивые к антибиотикам, потерявшие ферменты и т.д.
Генетические взаимодействия между вирусами:
Комплеметация – если 1 вирус дефектен по к.-л. гену, или оба вируса дефектны по разным генам, то они продолжают расти в ассоциации в клетке. Если же оба вируса дефектны по одному и тому же гену, то комплементации нет.
Рекомбинация – вз-вие между вирусными геномами в смешанно-зараженных клетках, в рез-те чего дочерние геномы содержат генетический материал в комбинациях, отсутствующих у родителей.
Генетич. реактивация – частный случай рекомбинации, когда 1 или оба вируса неинфекционны, но при смешанном заражении дают потомство, которое несет инфекц. признаки.
Негенетические взаимодействия вирусов:
Гетерозиготность – состояние, при котором диплоидные хромосомы различаются по аллельным маркерам в 1 или нескольких локусах.
Интерференция бывает неск. типов:
а) гомологичная интерференция – хотя дефектный интерферирующий вирус конкурирует за компоненты репликационного аппарата с полными вирусами, они необязательно мешают репродукции полного вируса
б) супрессия – подавление мутантного феномена супрессорной мутацией. Фенотип вирусной мутации подавляется второй мутацией либо в вирусе, либоб в клетке, проиводя к реверсии фенотипа вируса, содержащего исходную мутацию.
Дефектные вирусные геномы:
Дата добавления: 2015-10-02; просмотров: 67 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| VІІ. Інструктаж з домашнього завдання. | | | ЗНАЧЕНИЕ мкÒ ДЛЯ ОКР СРЕДЫ |