РБТЛ (реакция бласттрансформации лимфоцитов

Основан на наличии митогенов, специфически действующих на Т- или на В-лимфоциты, что позволяет раздельно судить о функциональной активности Т- и В-клеток. (Так, ФГА и конканавалин А стимулируют Т-кл., а митоген Лапокосса и ЛПС эшеришии (E.coli) – В-клетки. Схема постановки реакции:

1) выделение лимфоцитов

2) подсчет кол-ва клеток и доведение суспензии до нужной концентрации

3) посев клеток и их последующее культивирование в течение 72 часов

4) регистрация результатов, включая:

а) приготовление мазков для подсчета процента стимулированных лимфоцитов

б) определение интенсивности включения Н-3-тимидина (³Н)

РТМЛ (реакция торможения миграции лейкоцитов)

Используется для изучения акитвности лимфокининов. В основе РТМЛ лежит способность гранулоцитов и моноцитов крови, а также макрофагов к свободной миграции, которая тормозится под действием лимфокина. Миграцию и ее торможение под влиянием лимфокинов изучают в специальных капиллярах или на стекле под слоем агарозы. Результаты ингибиции миграции оценивают по разности площадей миграции клеток.

Оценка гуморального иммунитета (В-системы) включает определение кол-ва В-лимфоцитов в крови с помощью теста розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами, несущими на своей поверхности комплекс (антиэритроцитарные АТ + комплемент), с целью выявления на лимфоцитах рецепторов для комплемента и теста иммунофлюоресценции с использованием антисывороток против иммуноглобулинов чка. Функциональную активность В-лимфоцитов оценивают косвенно по уровню сывороточных иммуноглобулинов различных классов – IgG, IgM, IgA, IgE.

35. Комплемент. Свойства, структура, роль в организме, механизмы активации.

СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА – многокомпонентная самособирающуюся систему белков сыворотки крови, к/я играет важную роль в поддержании гомеостаза. Активируется в процессе самосборки, т.е. последовательного присоединения к образующемуся комплексу отдельных фракций (их 9). Продуцируются они ## печени, мононуклеарными фагоцитами и содержатся в сыворотке крови в неактивном состоянии.

Процесс активации комплемента инициируется 2 путями:

Классический путь (1-4-2-3-5-6…). Инициирующим фактором является иммунный комплекс Аг-Ат, причем только содержащие Fc-фрагменты – IgG и IgM могут связывать С1-фракцию комплемента. При присоединении С1 к иммунному комплексу образуется Cl-эстераза → формируется энзиматически активный комплекс (С4b+С2а) – С3-конвертазой. Этот фермент расщепляет С3 на С3а и С3b. При взаимодействии субфракции С3b с С4 и С2 образуется пептидаза, действующая на С5. Если инициирующий иммунный комплекс связан с # мембраной, то самособирающийся комплекс С1-4-2-3 обеспечивает фиксацию активированной фракции С5, а затем С6 и С7. Последние три компонента фиксируют С8 и С9. При этом С5а+С6+С7+С8+С9= мембраноатакующий комплекс, после его присоединения # лизируется (гемолиз эритроцитов или бактериолизис).

Особенность альтернативного пути (D-B (P)) в том, что инициация может происходить без участия иммунного комплекса за счет ЛПС # стенки гр–, поверхностных структур вирусов, иммунных комплексов, включающих IgA и IgE. В этом случае необходимо участие сывороточного белка (пропердин), который активен лишь в присутствии ионов Mg²⁺ и факторов В и D. Фактор D в активной форме – протеиназа, расщепляет фактор В с образованием фрагмента Вb, к/й в комплексе с С3b является С3-конвертазой. Функция пропердина – стабилизация комплекса С3b-Вb.

При активации комплемента появляются продукты протеолиза компонентов С4, С2, С3 и С5. Одни из них (фрагменты С4b, С2b, С3b, С5b) участвуют непосредственно в самосборке и активации системы комплемента. В отличие от них низкомолекулярные фрагменты С3а и С5а (АНАФИЛАТОКСИНЫ) играют роль в патогенезе болезней иммунных комплексов и других заболеваний, при которых резко ↑ связывание и активация комплемента в Ò.

Комплемент выполняет ряд функций:

цитолитическое и цитотоксическое действие клетки-«мишени»;

анафилотоксины участвуют в иммунопатологических реакциях;

↑ эффективность фагоцитоза иммунных комплексов (через Fc-рецепторы);

фрагмент С3b способствует связыванию и захвату иммунных комплексов фагоцитами, опсонизируя объекты фагоцитоза;

фрагменты С3b, С5а и Вb (хемоаттрактанты), участвуют в развитии воспаления.

В здоровом организме идет постоянное формирование иммунных комплексов (против Аг аутофлоры) Þ белки комплемента быстро обновляются. Потребление комплемента резко ↑ при патологиях, связанных с усиленным образованием иммунных комплексов при инфекциях и иммунопатологических состояниях.

36. Радиоиммунный анализ.

Сходен с ИФА, но вместо фермента на иммуноглобулине фиксируется радиоактивная метка (напр., в состав Ig включается атом трития - ³Н). После обработки препарата раствором таких иммуноглобулинов радиоактивное излучение регистрируется (с помощью микродатчиков либо методо сцинтилляций в геле, либо др. методом).

Метод очень чувствителен и относительно легко выполним.

37. Кооперация клеток в иммунном ответе. Процессинг антигенов макрофагами и В-лимфоцитами. Лимфокины.

Патрульные макрофаги, обнаружив в крови чужеродные белки (клетку), предъявляют его Т-хелперам (происходит процессинг АГ макрофагами). Т-хелперы передают АГ информацию на В-лимфоциты, которые начинают бласттрансформироваться и пролиферировать, выделять нужный иммуноглобулин.

Меньшая часть Т-хелперов (индукторы) побуждают макрофагов и макрофаги начинают продуцировать интерлейкин I – активатор основной части Т-хелперов. Те, возбуждаясь, в свою очередь объявляют всеобщую мобилизацию, начиная бурно выделять интерлейкин II (лимфокин), который ускоряет пролиферацию и Т-хелперов, и Т-киллеров. Последние имеют специальный рецептор именно к тем белковым детерминантам, которые были предъявлены патрульными макрофагами.

Т-киллеры устремляются к клеткам-мишеням и разрушают их. Одновременно интерлейкин II способствует росту и созреванию В-лимфоцитов, которые превращаются в плазматические клетки. Тот же интерлейкин II вдохнет жизнь в Т-супрессоры, которые замыкают общую реакцию иммунного ответа, останавливая синтез лимфокинов. Размножение иммунных клеток прекращается, но остаются лимфоциты памяти.

38. Реакция непрямой гемагглютинации и реакция коагглютинации, механизм, практическое использование.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обычных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабатывают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пуговицы»

Дата добавления: 2015-10-02