Проведение процедуры обратной транскрипции

На этом этапе в результате проведения процедуры обратной транскрипции мы получали полноразмерную первую цепь комплиментарной ДНК (кДНК) из выделенной ранее матрицы мРНК.

В качестве праймера были выбраны случайные гексонуклеотиды. Они неспецифически связываются на мРНК, нарабатывая короткие кДНК практически по всей матрице мРНК. Такие праймеры подходят для изучения всей последовательности мРНК, особенно 5` район.

Реактивы:

1. M-MLV обратная транскриптаза

2. х10-кратный ОТ буфер для фермента

3. 2,5 mM смесь dNTP

4. Гексапраймеры

5. Вода, свободная от Рназ

Ход работы:

Все манипуляции проводятся на льду, т.е. при температуре +4⁰С.

В пробирке смешали 5 мкл полученной ранее мРНК, 1мкл случайного гексапраймера и довели объем смеси до 18 мкл водой, свободной от РНаз. Перемешивали и осаждали капли кратковременным центрифугированием.

Смесь инкубировалась 5 минут при +70⁰С, после чего пробирка переносилась в лед. Капли собирались кратковременным центрифугированием.

На льду в пробирку добавляли следующие компоненты: 0,5мкл M-MLV обратной транскриптазы, 2,5мкл х10-кратного ОТ буфера для фермента, 4мкл 2,5mM смесь dNTP. После чего смесь инкубировалась сначала 10 минут при температуре +25⁰С, затем в течении 1 часа при температуре +37⁰С. Реакция останавливалась путем нагревания смеси до +70⁰С на протяжении 10 минут, после чего смесь переносили в лед.

Синтезированная кДНК может быть сразу использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования. Кроме того, полученный материал можно хранить при температуре –20⁰С и ниже. Мы проводили ПЦР в день выделения РНК и синтеза кДНК, для того чтобы максимально сохранить полученный материал.

Дата добавления: 2015-09-01