Культивирование клеток

Реактивы:

1. Среда для культивирование DMEM

2. Фосфатно-солевой буфер

3. 0,05% раствор трипсина

4. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)

5. РНК-сохраняющий раствор EverFresh

Оборудование:

Ход работы:

Культивация клеток проводилась в испытательной лаборатории биологической активности и токсикологической безопасности ОАО «Завод экологической техники и экопитания ДИОД»

Для получения образцов РНК использовалась культура клеток Hela. Клетки HeLa культивировали в среде DMEM с 0,3 мг/мл L-глутамина с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (Cibro BRL, США), 100 ед/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в контролируемых условиях (+37⁰С, 5% СО₂) в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см² (посевная концентрация 1х10⁶ клеток/флакон).

Непосредственно перед тестированием клеточный монослой 2 раза промывали фосфатно-солевым буфером без ионов кальция и магния, после чего заливали на 5 минут 0,05% раствором трипсина (1 мл раствора на флакон). Затем инактивировали трипсин средой для культивирования клеток DMEM, осторожно пипетировали клетки в среде до образования однородной суспензии. После чего клетки осаждали центрифугированием (5 мин 400 g). После этого клетки еще 2 раза отмывали в охлажденном растворе фосфатно-солевого буфера и ЭДТА (+4°С).

Жизнеспособность клеток оценивалась окраской 0,4% трипанового синего. Суспензию клеток разводили до концентрации 1х10⁷ кл/мл (подсчет клеток осуществлялся в камере Горяева). Хранение клеток возможно при температуре +4°С не более 3 часов.

Для лучшего сохранения РНК суспензия клеток заливалась тройным объемом раствора EverFresh.

Дата добавления: 2015-09-01