Особенности селекции молочнокислых микроорганизмов

В течение вековой практики использования для лечебных целей пищевых продуктов с пробиотиками молочнокислые бактерии для заквасок выделяют в специальных лабораториях из различных источников: рыночное молоко и кисломолочные продукты, растения, фрукты, овощи, хвоя (естественная селекция). При селекции ценных производственных штаммов молочнокислых бактерий, чаще всего, обращают внимание на:

- высокую энергию кислотообразования;

- способность накапливать ароматические вещества;

- фагоустойчивость;

- специфические свойства продукта, для которого предназначается штамм (характеристика сгустка, направленная на получение желательных аминокислот протеолитическая активность, ограниченная липолитическая активность и т.д.) [1].

Важным требованием при подборе производственных штаммов для пробиотических продуктов должна быть их высокая колонизационная активность, или способность приживаться в кишечнике. При этом особое внимание следует обращать на такие факторы колонизации как антибиотическая и адгезивная активности.

Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационного процесса и в большинстве случаев желательна для ПБ, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе штаммов для пробиоитческого бактериального препарата или функционального продукта питания, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогенов и пробииотика целью выяснить, может ли данный ПБ конкурировать с патогенами за субстраты связывания и тем самым препятствовать колонизации последних в организме. Блокирование адгезии патогенных микроорганизмов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты. Поэтому правильный подбор к пробиотическому штамму (или консорциуму штаммов) пребиотика – существенно повышает эффективность обоих.

Штаммы новыми свойствами возникают в результате мутаций. Мутации - это изменения в последовательности нуклеотидов ДНК, проявляющиеся наследственно закрепленной утратой или изменением какого-либо признака или группы признаков. В их основе лежат ошибки копирования наследственной информации, возникающие при репликации. Фенотипическим проявлением мутации могут быть: изменение свойства штамма, в.т.ч. производственно-ценного. Мутации у бактерий носят ненаправленный характер [1].

Мутации возникают в природной и лабораторной популяции особей всегда без видимых воздействий на популяцию. Такие мутации, причины возникновения которых нам неизвестны, называются спонтанными. Вероятность возникновения спонтанных мутаций у микроорганизмов (1·10^-10- 1·10^-6) ниже, чем у растений и животных (1·10^-6-1·10^-4). Но вероятность выделения мутаций по данному гену у бактерий значительно выше, чем у всех других организмов, поскольку получить многомиллионное потомство у микроорганизмов довольно просто. Для выявления мутаций служат селективные среды, на которых способны расти мутанты, но погибают родительские клетки исходного штамма. Однако, давно известно, что, например, лактококки, выделенные из природных источников показывают меньшую чувствительность к фагам, чем те культуры, которые длительное время поддерживались в питательной среде, свободной от фага. В природе существуют селективные условия для отбора спонтанных (естественных) фагорезистентных мутантов. Один из объясняющих это механизмов связан с явлением фагоносительства (псевдолизогении), при котором культуры могут быть заражены фагом, не будучи впоследствии лизированными. Эти культуры, называемые лизогенными, несущие фаг (профаг), менее чувствительны к атаке другими бактериофагами, чем их бесфаговые копии.

На основании явления фагоносительства, используют два варианта селекции заквасочных штаммов:

1) По-существу отсутствие селекции в узком смысле слова, когда при производстве ферментированных молочных продуктов используют сбалансированную за многие годы смесь лизогенных, фагоустойчивых и фагочувствительных штаммов, что делает такие закваски исключительно устойчивыми. Пример: закваски «Флора Даника», использующиеся в Голландии и др. странах. В их фильтрате может содержаться до 10⁸ вирионов, которые не мешают активности закваски.

2) Так называемая, естественная селекция, когда штаммы закваски (чаще по одному) для «придания» им свойства резистентности культивируют в присутствии коллекционных, или выделенных на конкретном производстве, фагов [1].

В системе мероприятий по борьбе с фаголизисом при производстве ферментированных молочных продуктов, одним из главных звеньев является селекция фагорезитентных культур закваски, т.е. направленный отбор клонов по ряду свойств, определяющих их производственную ценность, в т.ч. фагоустойчивость.

Воздействуя на молочнокислые бактерии различными мутагенными факторами можно быстрее получить новые штаммы микроорганизмов с требуемыми свойствами. Повышать частоту мутаций по сравнению со спонтанным фоном, т.е. индуцировать их, могут физические, химические и биологические факторы, действующие на генетический материал клетки. Физические факторы – это, прежде всего, коротковолновое излучение (УФ-излучение и рентгеновские лучи), гамма-лучи. К химическим мутагенам относятся аналоги оснований, производные акридина, алкилирующие и дезаминирующие агенты. Биологические факторы - это в первую очередь мигрирующие элементы (транспозоны и IS-элементы).

Частым типом структурных повреждений ДНК, вызываемых УФ-излучением, является образование пиримидиновых димеров в результате ковалентного связывания соседних пиримидиновых оснований. Реже УФ вызывает разрыв водородных связей, образование межцепочечных поперечных сшивок и поперечных сшивок между ДНК и белком. Ионизирующие излучения всех видов вызывают главным образом одноцепочечные разрывы в ДНК; разрывов, поражающих обе цепи, обычно на порядок меньше. Различные химические мутагены индуцируют образование внутрицепочечных и межцепочечных поперечных сшивок и одноцепочечные разрывы ДНК [1].

Пиримидиновый димер (рис. 1) - дефект ДНК, возникающий в результате образования ковалентной связи между двумя соседними пиримидиновыми основаниями (тимидином или цитозином) под действием ультрафиолетовых лучей. Ультрафиолетовые лучи вызывают разрыв двойной связи и образование в этом месте ковалентной связи между двумя нуклеотидами. Образование димера приводит к нарушению транскрипции ДНК на данном участке и возникновению мутаций.

Р и с. 1. Образование пиримидинового димера [2]

Наследственная информация у бактерий хранится в форме последовательности нуклеотидов ДНК хромосомы и плазмид. Размеры бактериальной хромосомы у молочнокислых микроорганизмов составляют 10 ⁸ - 10 ⁹ Д. Генетическая информация в бактериях может содержаться во внеядерных (внехромосомных) молекулах ДНК, представленных плазмидами, транспозонами и IS-элементами.

Плазмиды бактерий представляют собой двунитевые молекулы ДНК размером от 10 ⁶ до 10 ⁸ Да, несущие от 40 до 50 генов. Они не считаются жизненно необходимыми, так как не кодируют информацию о синтезе ферментов, участвующих в основном метаболизме бактериальной клетки. Благодаря современным достижениям генетики известно, что количество плазмид в микроорганизмах может быть от 0 до 200. Штаммы молочнокислых микроорганизмов содержат наборы плазмид, включающие от 0 до 12 (обычно 4-7) кольцевых ковалентнозамкнутых молекул ДНК массой от 1 до 80 МДа.

Сравнительно более широкие перспективы получения производственно-ценных штаммов открывает использование различных способов рекомбинации генов: конъюгации, трансдукции, трансформации. Часто прибегают к трансдукции (перенос гена из одной бактерии в другую посредством бактериофагов), трансформации (перенос ДНК, изолированной из одних клеток, в другие).

Рекомбинация (recombination) - перераспределение генетического материала родителей, приводящее к наследственной комбинативной изменчивости. В общем смысле под рекомбинацией понимают создание новой комбинации генов при соединении генетических факторов родителей. У прокариот рекомбинация осуществляется в процессе конъюгации, трансформации либо трансдукции, у вирусов – при смешанной инфекции. Различают реципрокную (взаимный обмен участками молекулы ДНК), нереципрокную (односторонний перенос участка ДНК); общую (кроссинговер), сайт-специфическую и незаконную рекомбинацию (обмен участками негомологичных хромосом в результате хромосомных перестроек). Иногда прибегают к трансдукции (перенос гена из одной бактерии в другую посредством бактериофагов), трансформации (перенос ДНК, изолированной из одних клеток, в другие).

При генетических рекомбинациях в хромосому (плазмиду) бактериальной клетки-донора встраивается фрагмент хромосомы или плазмиды клетки-донора. Образующиеся рекомбинанты, в-основном, сохраняют генотип микроба-реципиента, приобретаются только отдельные свойства донора-микроба, т.е. происходит нереципроктрая рекомбинация.

Конъюга́ция (от лат. Conjugatio — соединение) - однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессов горизонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации. В клетке-доноре должна присутствовать конъюгативная (трансмиссивная) плазмида. Плазмида несёт гены, кодирующие ряд функций. Одна из них- образование, так называемых, пилей, отвечающих за приклепление к клетке-реципиенту. Неконъюгамивная плазмида может передаваться в клекту-реципиент с помощью Тра-генов конъюгативной плазмиды.

Для молочнокислых микроорганизмов успешно использовали индуцированный мутагенез, различные способы рекомбинации генов: конъюгацию, трансдукцию, трансформацию и другие генетические процессы. При индуцированном мутагенезе молочнокислых микроорганизмовчаще всего возникает образование пиримидиновых димеров, иногда разрыв водородных связей, одноцепочечные разрывы в ДНК, образование внутрицепочечных и межцепочечных поперечных сшивок ДНК, межцепочечные поперечные сшивоки между ДНК и белком. При конъюгации – нереципроктрая рекомбинация. Частота индукции и рекомбмнации обычно составляет 10^-9 -10^-7. Более высокая эффективность получения мутантов– следствие использования рекомбинации с участием инвертированных повторов IS-элементов, транспозонов.

Важно подчеркнуть, что индуцированный мутагенез и рекомбинация – всего лишь методы более эффективного получения мутаций, или рекомбинаций, соответственно, которые происходят в естественных условиях в природе.

Совершенно иным подходом в селекционной работе с микроорганизмами является получение рекомбинантов путем слияния протопластов, которое позволяет объединить генетические материалы и таких микроорганизмов, которые в естественных условиях не скрещиваются, или использование двурепликонных плазмид с геном антибиотикоусточивости. В этих случаях, маркер антибиотикоустойчивости, может самопроизвольно конъюгативно передаваться в неродственные микроорганизмы, в т.ч. патогены, что является препятствием для использования такого рекомбинанта в составе пробиотического бактериального препарата или продукта функционального питания.

Полученные нами методом генетической рекомбинации (конъюгативной передачей) штаммы лактококков с повышенной фагоустойчивостью обладали в около 30% случаев стабильностью приобретенного признака фагорезистентности и физиолого-биохимическими свойствами, позволяющими использовать рекомбинантные штаммы в качестве заквасочных. По результатам данной работы отобрано и передано в Экспериментальную биофабрику (г. Углич) 8 рекомбинантных культур лактококков с повышенной фагоустойчивостью, сохранивших свои свойства в течение длительного времени использования в составе бактериальных препаратов для сыров [1].

Литература:

1. Полянская И.С., Тераевич А.С., Топал О.И., Новокшанова А.Л., Забегалова Г.Н. Нутрициологические, микробиологические, генетические и биохимические основы разработки и производства продуктов с пробиотиками. – Вологда-Молочное: ИЦ ВГМХА, 2013. – 200 с.

2. Пиримидиновый димер. – Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0, - свободный.

Дата добавления: 2015-08-27