Что такое повторение последовательности?

При построении, во время первого шага использования термоциклера, создается множество копий необходимого ДНК, но с одной неточностью: вы обрываете процесс репликации ДНК на неизвестной стадии копирования и потому копии всех частей построения различной длины. Реакционная смесь включает в себя нормальные диоксинуклеотиды (А, Ц, Г, Т) а также некоторое количество ддеоксинуклеотидов (А*, Ц*, Г*, Т*) которыми метят флуоресцентные маркеры. Флуоресцентные маркеры различаются для каждой основы и имеют определенное различное свечение (например: Г* - желтый, Т* - зеленый). Дидеоксинуклеотииды могут замещать нормальные диоксинуклеотиды во время репликации, но замещение происходит случайным образом и эта цепочка может не растянуться на длину отличную от цепочки ДНК. Такие дидеоксинуклеотиды называют терминаторами. (Смотри графическую картинку в анимации этой лаборатории).

Рассмотрим определенный пример. Построение шесть-базовой-длины определенной цепи ДНК (состоящей из последовательности 3` А-Ц-Г-Т-Т-Г 5`) в этой методике, Вы энергично начинаете размножать цепочку этой одной шести базовой длины. Так как ДНК полимераза разрывает копию ДНК от 5` конца до 3` конца (то есть от 5` конца до 3` конца этого образца ДНК) кусочки расходятся (помним, что А соответствует Т, а Ц соответствует Г)

Т*

Т-Г*

Т-Г-Ц*

Т-Г-Ц-А*

Т-Г-Ц-А-А*

Т-Г-Ц-А-А-С*

Во всех эти куски, последним (3` конца) основанием являются диденуклеотиды. Однажды сделав такие кусочки, вы можете разделять их основания на требуемую длину очень чувствительным способом гелевого электрофореза. Так как каждый отдельный размер цепи ограничена определенным основанием (для например Т-Г-Ц* заканчивается на Ц*), которое флуоресцирует определенным цветом. При рассмотрении цвета свечения ДНК цепочки определяется ее размер, вы можете регулировать построение для комплиментарного ДНК. (Т-Г-Ц-А-А-Ц), из которой вы можете определить оригинальную последовательность.

Т*

Т-Г*

Т-Г-Ц*

Т-Г-Ц-А*

Т-Г-Ц-А-А*

Т-Г-Ц-А-А-С*

Конечно, чтобы это работало репликация должна начаться с того же места на изучаемой ДНК. В вышеприведенном примере на учитываются такие кусочки как Г-Ц-А* (позиция 2-3-4), вращение по кругу. В добавок нормальный образец ДНК содержит двойные цепочки ДНК, которые могут проявлять себя не только как мы желаем (3` Т-Г-Ц-А-А-С 5`), но и комплиментарно (5` А-Ц-Г-Т-Т-Г 3`). Комплиментарные цепочки могут создавать такие куски как Г-Т-Т*, которые тоже нежелательны. Этих проблем надо остерегаться при использовании праймеров, что ограничивает специфическое определение последовательности одной цепочки. В нашем примере вместо шести оснований, рассматривается десять оснований цепи с четырьмя основаниями, от 3` конца фактической последовательности (3` Т-Г-Т-А-А-Ц-Г-Т-Т-Г 5`). Используются праймеры с последовательностью 3` А-Ц-А-Т, репликация всегда начинается в одном и том же месте и получается такой рост ДНК кусочка:

А-Ц-А-Т-Т*

А-Ц-А-Т-Т-Г*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц-А*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц-А-А*

А-Ц-А-Т-Т-Г-Ц-А-А-Г*

Данное слияние прерывается в конечной точке случайно, это затрудняет изготовление очень больших копий ДНК, также нежелательно делать очень короткие копии в этой реакции. В дальнейшем определяют длинные цепочки электрофорезом сложность которого в том, что он определяет только одно основание. Таким образом в последовательности длинных цепочек ДНК, используется много праймеров, каждый для своей реакционной пробирки. Данным путем перекрывается несколько секций параллельных последовательностей, результат компилируется и создается комплиментарная последовательность.

В этой лаборатории мы используем набор из 12 праймеров; семь для каждой цепочки от двойной цепи ДНК. Теоретически можно использовать один праймер в ПЦР определении последовательности, но это невыполнимо для длинных последовательностей. С множеством праймеров с короткими перекрытиями последовательности ДНК получают полную последовательность. В добавок нет абсолютной необходимости определения последовательности обеих цепочек, хотя упорядочивание обеих цепочек дает излишек информации, что снижает возможность ошибки. От точности нумерации и расположения праймеров используемых в реакции зависит их доступность и пригодность к использованию. Праймеры применяемые в данной лаборатории доступны в коммерческих источниках и связывают закрытые части 16S рДНК гена. Таким образом они определяют последовательность независимо от вида бактерии.

Все зеленые и голубые пробирки содержат последовательно смешанные буфер, праймеры (определенные для каждой пробирки), ДНК полимеразу, нуклеотиды и помеченные флуоресцентом метки-терминаторы в соответствующих пропорциях. Продукт ПЦР, полученный в прошлом шаге, добавляется в каждую из пробирок и ПЦР повторяют сначала. Целью этого является не получение тех же копий ДНК, но множества копий различной длины. Анимация иллюстрирует события происходящие в одной из пробирок содержащей праймеры 651R. Все ДНК цепочки связаны праймерами с одного конца и флуоресцированные метки терминаторы с другого конца.

Часть 5 Упорядочивание ДНК

После последнего шага у Вас имеется 12 пробирок содержащих конечный продукт ПЦР, смесь кусков ДНК различной длины. Все ДНК куски в каждой пробирке начинаются с идентичных праймеров, но заканчиваются с различными мечеными флуоресцирующими маркерами нуклеотидами (различного цвета для каждого нуклеотида А, Т, Г, Ц). Остатки заканчивающее разделение отдельных цепочек ДНК и определяющие конечные нуклеотиды. В заключение применяется автоматический анализатор для выполнения гелевого электрофореза ДНК из каждой пробирки. Гелевый электрофорез – метод молекулярного разделения основ в зависимости от их длины. Анализатор используемый в этой лаборатории состоит из тонких капиллярных пробирок прикрепленных к одному концу и нагнетающего механизма, который подает буферный раствор. Капилляры наполняются буферным раствором и противоположным концом вставляются в пробирки с кусочками ДНК. Затем подводят электрический ток, таким образом, что конец капилляра контактирующий с ДНК приобретает отрицательный заряд, а нагнетающий конец – положительный. После чего молекулы ДНК приобретающие отрицательный заряд начинают двигаться сквозь капилляры к положительно заряженному концу, при этом маленькие кусочки ДНК движутся быстрее чем большие. Ближе к нагнетающему конца капилляр проходит сквозь лазерное перекрытие, где возбуждаются флуоресцентные маркеры и оптический детектор считывает цвет флуоресцента.

Мы можем получить полный набор ДНК кусочков, все различия в размерах точно одного нуклеотида сгенерированного в прошлом шаге. Мельчайшие кусочки ДНК имеющие флуоресцирующую метку прикрепленную к этому праймеру. Эти фрагменты ДНК перемещаемые ускорителем. При считывании цвета (в нашем примере красного) мы выделяем какой нуклеотид следующий за праймером Тимин (Т). Следующий мелкий кусочек ДНК имеет зеленое свечение отображающий следующий нуклеотид в последовательности Аденин (А) и так далее (смотри анимацию). После прочтения последовательности базовых нуклеотидов по их свечению, всех кусочков ДНК лазерный барьер, последовательность ДНК может быть восстановлена. Автоматический анализатор перемещает пробирки в капиллярах к лотку и начинает электрофорез, повторяя программу до тех пор пока все 12 пробирок не будут исследованы. После определения последовательности проверяют на компьютерной программе на совпадение с последовательностью с 16S рДНК гена.

Часть 6 Анализ последовательности ДНК.

После считывания информации все реакционные пробирки извлекаются, компьютер составляет действительную последовательность сопоставляя разрозненные куски. Теперь у Вас есть 16S рДНК последовательность этого вида бактерии которую можно сравнить со всеми другими известными 16S рДНК последовательностями для идентификации.

Все множество последовательностей хранится в действительной базе данных. Эта база данных является коммерческой и оплачивается как часть идентификационного оборудования. В этом примере мы будем использовать ГенБанк общественной базы данных входящий в состав Национальной Медицинской библиотеки. Множество последовательностей известно как BLAST (Основная локальная база поиска инструмента). Огромное множество ДНК последовательностей помогает точно определить искомый вид бактерии. Если из множества последовательностей Вы не обнаружили искомую, то это либо новый вид, либо вариации существующего.

Нажмите продолжить для начала процесса определения.

Ниже результаты данной ДНК последовательности. Эти данные надо скопировать и поместить в имитатор BLAST поисковой страницы.

Нажмите кнопку «Copy» для выделения и копирования данных.

Нажмите кнопку «BLAST» для продолжения работы с имитатором поисковой страницы.

Перевод строчек подсказок в маленьком левом окне:

Добро пожаловать в виртуальную бактериальную ID лабораторию. Начнем, наденьте пожалуйста пару резиновых перчаток, для чего нажмите на коробку перчаток расположенную в открытом ящике.

Теперь достаньте образец культуры из чашки Петри. Кликните на проволочную петлю для продолжения.

Поместите конец проволочной петли над одной из колоний в чашке и кликните над выбранной колонией.

Дата добавления: 2015-08-26