Расщепление ДНК 1-10 фенантролином

Наряду с исследованиями комплекса блеомицина с металлами, активно изучается также подобные комплексы противоопухолевых хелатирующих агентов, таких как 1,10-фенантролин, 5-нитро-1,10-фенантролин, 5-хлор-фенантролин [36]. Последние два производных более эффективно расщепляют ДНК, вызывая к себе повышенный интерес. При этом расщепление происходит скорее всего не по специфическим сайтам ДНК. По-видимому, комплекс о-фенантролина с медью интеркалирует в ДНК и впоследствии окисляется с помощью кофактора Н₂О₂ с образованием при этом ОН ^· -радикалов [37] в местах присоединения. В последнее время широко исследуются также комплексы этих хелатов с металлами переменной валентности в присутствии кофактора - Н₂О₂. Некоторые эту реакцию проводят в 0,1 М трис-ацетатном буфере (рН 7.0) и 5 мМ ацетата магния [38]. Вместе с тем известно, что трис является гасителем ОН ^· - радикалов, поэтому реакцию лучше проводить в другом буфере, скажем 20 мМ натрий-фосфатном (рН 7.5). Значительный прогресс в этом направлении был достигнут в лаборатории Сигмана [39]. Однако, до конца механизм действия комплекса [Cu(phen)₂]⁺ на ДНК в настоящее время не изучен. Знание такого механизма в будущем может позволить понять общий механизм деградации ДНК, катализируемый свободными радикалами, для синтеза и изучения многих антираковых препаратов, таких как неокарциноститин, дианомицин, митомицин и многих других.

Механизм действия комплекса 1,10-фенантролина с медью заключается в следующем: 1,10-фенантролин присоединяется к двухцепочечной ДНК, и в случае присутствия Н₂О₂ в смеси происходит быстрое окислительное расщепление ДНК. Быстрее всего расщепляется В-форма ДНК, слабее - А-форма и совсем не деградирует Z-форма ДНК. Таким образом, [Cu(phen)₂]⁺ узнает спиральную конформацию ДНК даже при отсутствии некоторых специфических последовательностей.

Способность вызывать расщепление ДНК с помощью комплекса [Cu(phen)₂]⁺ была открыта в лаборатории Сигмана в 1979 году при исследовании ингибирования 1,10-фенантролином реакции полимеризации poly[d(A-T)], катализируемой ДНК-полимеразой I из Е.Сoli [40]. Было показано, что эта активность 1,10-фенантролина инициировалась также в присутствии ионов Zn. Как оказалось, сходную роль инициаторов расщепления могут играть также ионы меди (II) и серы (II). При инкубации poly[d(AT)]вместе с 1,10-фенантролином, Cu²⁺ и меркаптопропионовой кислотой в аэробных условиях происходило сильное ингибирование нуклеазоподобной активности. Эффективность реакции продуцирования ОН ^· - радикалов в смеси [Cu(phen)₂]⁺ и Н₂О₂ существенно усиливалась при добавлении меди уже в микромолярных количествах. Первым достижением в исследовании такой реакции явилось выяснение отдельного влияния компонентов реакции на образование разрывов в ДНК. Ингибирование реакции каталазой позволило понять исключительно важную роль перекиси водорода как кофактора в реакции. Вместе с тем, даже при отсутствии Н₂О₂, реакция может продолжаться, так как последний может быть генерирован в реакционной смеси, содержащей 1,10-фенантролин, Cu²⁺, серу и кислород. Образование Н₂О₂ сводится к следующему [41]:

[Cu(phen)₂]²⁺ + RSH [Cu(phen)₂]⁺ +1/2 RS-SR

2[Cu(phen)₂]⁺ + O₂ + 2H⁺ 2[Cu(phen)₂]²⁺ + Н₂О₂

Однако сама по себе перекись водорода в низких концентрациях не может обуславливать большую скорость расщепления ДНК. Одноцепочечные разрывы, возникающие в присутствии (OP)₂Cu⁺ проявляют значительный синергизм, который проявляется в скорости разрушения poly-[d(AT)], при добавлении в эквимолярных соотношениях (7мМ) перекиси водорода и меркаптопропионовой кислоты в раствор, содержащий 10 мМ 1,10-фенантролина и 1 М ионов Cu²⁺ [42]. Расщепление ДНК может происходить и вследствии действия пероксидных анионов в присутствии 1,10-фенантролина, Cu²⁺, [Cu(phen)₂]²⁺ и спонтанно возникающих ионов Н₂О₂

[Cu(phen)₂]²⁺ + [Cu(phen)₂]⁺ + О₂

2Н⁺ + 2O₂ Н₂O₂ + O₂

Следовательно, расщепление ДНК при этом включает в себя присоединение [Cu(phen)₂]⁺ комплекса к ДНК, после чего этот комплекс взаимодействует с перекисью водорода, образуя разрыв фосфодиэфирной связи:

[Cu(phen)₂]⁺ + DNA [Cu(phen)₂]⁺ --- DNA

[Cu(phen)₂]⁺ OH --- DNA олигонуклеотидные продукты

Из изложенного выше понятно, что 1,10-фенантролин при расщеплении ДНК играет как минимум две роли. Первая роль заключается в формировании комплекса с Cu⁺ или Cu²⁺. Вторая же - в переносе этого комплекса, на ДНК. Ингибирование реакции можно вызвать уменьшая концентрацию [Cu(phen)₂]⁺ или перекиси водорода.

Интересны также данные о производных 1,10-фенантролина. Так 2,9- замещенные производные 1,10-фенантролина, не расщепляют ДНК подобно нуклеазам, благодаря способности к формированию комплекса с Cu(II). 4,7- замещенные производные 1,10-фенантролина неактивны, когда происходит замещение на фенил.

1.3.2. Роль Cu(II) и Н₂O₂

В ранних исследованиях было установлено, что каталаза ингибирует неспецифическое расщепление ДНК, в то же время О₂ в присутствии [Cu(phen)₂]⁺ его стимулирует. Супероксид может способствовать превращению Cu(II) в Cu(I):

[Cu(phen)₂]²⁺ + [Cu(phen)₂]⁺ + О₂

2Н⁺ + 2O₂ Н₂O₂ + O₂

[Cu(phen)₂]⁺ + Н₂O₂ [Cu(phen)₂]²⁺ + НО ^· + НO^- или (Phen)₂[CuOH].

и также стимулировать реакцию образования Н₂O₂. Таким образом, могут продуцироваться оба кофактора, подвергающиеся химическим превращениям по Фентону [43], вследствие чего происходит расщепление ДНК в присутствии кислорода.

1.3.3. Модель присоединения комплекса 1,10-фенантролин-Cu⁺ к ДНК

По всей видимости, расщепление ДНК с помощью 1,10-фенантролина происходит по следующему пути. Комплекс [Cu(phen)₂]⁺ взаимодействует с В конформацией ДНК и присоединяется внутри ее малой бороздки в местах расположения атомов водорода в положении С1 и С4 дезоксирибозы. Такой механизм реакции был предложен Дрю и Траверсом [44] и убедительно доказан в исследованиях с помощью футпринтинга. В группе Диккерсона было обнаружено, что такое взаимодействие через малую бороздку происходит преимущественно в местах расположения тетрануклеотида ААТТ [45].

Двухцепочечная А конформация ДНК, способна расщепляться комплексом [Cu(phen)₂]⁺ в три раза слабее, чем В-конформация. Этот комплекс может присоединяться к полинуклеотидам более чем в одном сайте дезоксирибозы. Все это говорит о том, что конформация ДНК влияет на интенсивность ее расщепления. С химической точки зрения, деградация ДНК с помощью такого комплекса в присутствии кислорода напоминает механизм расщепления полинуклеотидов с помощью РНКаз и ДНКаз. Однако, исследования методом футпринтинга, в частности, эксперименты по метилированию ДНК с помощью диметилсульфата, показали полное отсутствие цитозина в сайтах расщепления.

По-видимому, расщепление ДНК в присутствии комплекса [Cu(phen)₂]⁺ происходит с невысокой скоростью и окончательный его химический механизм в настоящее время еще не выяснен. Результаты о предпочтительном расщеплении В-конформации ДНК показывают высокую конформационную специфичность такой реакции [46]. Этот комплекс не расщепляет или расщепляет очень слабо цепи другой конформации, даже если эти цепи одноцепочечные и содержат гиперчувствительные сайты.

При исследовании влияния отдельных компонентов на ход реакции расщепления было обнаружено, что орто замещение в положении 2 или 2 и 9 комплекса блокирует расщепление. При замещении же в 5' положении комплекса [Cu(phen)₂]⁺ на -Br, -NO₂, -метил, -фенил, -амидоацетил и -aмидоглицил проявляется сходное расщепление. Замещение на фенил в положении 4 и 7 (так называемый батофенантролин) дает совершенно противоположный эффект. При его действии не наблюдается существенного расщепления ДНК даже чувствительной промоторной области. Комплекс 4,7-дифенилфенантролина с Cu(II) должен связываться, по-видимому, по совершенно другой геометрии, чем другие производные 1-10-фенантролина.

Дата добавления: 2015-08-17