Гемолиз и его количественное изучение

Термином «гемолиз» принято обозначать процесс выхода гемоглобина из эритроцитов с образованием клеточных остатков – заполненных внешней средой мембранных «мешочков», которые принято называть «эритроцитарными тенями». Причин гемолиза может быть несколько. Однако в любом случае распад эритроцита связан с тем, что механическое напряжение в его мембране превышает ее механическую стойкость. Таким образом, в принципе эритроцит может разрушиться либо вследствие существенного увеличения внутреннего давления на мембрану со стороны цитоплазмы, либо вследствие существенного снижения механической стойкости мембраны (т.е. ее повреждения). Впрочем, обычно и гемолиз вследствие увеличения внутреннего давления опосредуется нарушением структурно-функциональной целостности плазматической мембраны клетки.

Наиболее хорошо исследован гемолиз, протекающий по так называемому коллоидно-осмотическому механизму. Суть этого механизма состоит в следующем. Внутри эритроцита присутствует белок (в основном, гемоглобин, концентрация которого в цитоплазме эритроцита составляет около 30%) в количествах, значимо больших, чем в плазме крови. Из-за этого на плазматическую мембрану эритроцитарных клеток всегда действует онкотическое давление, направленное из цитоплазмы наружу. Для того, чтобы компенсировать это давление, с помощью специальных АТФаз (т.е. энергозависимо) клетка обеспечивает создание и поддержание трансмембранного градиента концентрации ионов (главным образом, Na⁺ и К⁺), который создает осмотическое давление противоположной направленности (т.е. действующее извне в сторону цитоплазмы эритроцита). В результате клетка пребывает в состоянии относительного равновесия и гемолиза не наблюдается. Однако при воздействиях, приводящих к снижению трансмембранного градиента концентраций ионов в эритроцитах, онкотическое давление перестает должным образом компенсироваться, внутрь клетки входит вода, ее объем быстро нарастает. Заканчивается это механическим разрывом мембраны и выходом гемоглобина в наружную среду, т.е. гемолизом. Причиной же исчезновения трансмембранного градиента концентрации ионов может быть либо инактивация поддерживающих этот градиент АТФаз, либо существенное увеличение ионной проницаемости самой цитоплазматической мембраны. Следует отметить, что при высокой концентрации эритроцитов объем внеклеточной среды может быть недостаточен для значимого прироста объема клеток. Поэтому в концентрированных эритроцитарных суспензиях (например, цельной крови) гемолиз по коллоидно-осмотическому механизму не наблюдается. Имеющиеся же повреждения плазматической мембраны в такой ситуации носят скрытый, латентный, характер, и при исчезновении факторов, мешающих гемолизу, он немедленно развивается.

Вызвать нарушение ионной проницаемости эритроцитарных мембран можно с помощью целого ряда физических и химических воздействий. В данной работе для этого применяется хлорамин В, который в водных растворах высвобождает активный хлор, вступающий в химическое взаимодействие с компонентами мембран эритроцитов, вызывая гемолиз.

Очень удобным методом исследования гемолиза является турбодиметрия. При гемолизе количество нелизированных клеток в объекте падает, следовательно, снижается концентрация рассеивающих центров, ослабляется светорассеивание, а доля прямо проходящего излучения (J_пп) растет. Обычно регистрируется зависимость J_пп или светопропускания Т эритроцитарной суспензии от времени после воздействия, т.е кинетика изменения светорассеивания в ней.

В типичных случаях регистрируемые кинетики имеют S-образный вид – по истечении некоторого латентного периода (определяемого степенью повреждения эритроцитарных мембран) начинает развиваться увеличение Т (регистрируемое как прирост J_пп), которое заканчивается выходом кинетики на плато. При полном гемолизе (т.е. в тех случаях, когда распадаются все имеющиеся в объекте эритроциты), величина Т достигает почти 100%, а величина J_пп – значения J_о. Если же гемолиз неполный (т.е. распались не все эритроциты), то по положению достигнутого плато можно определить, какая доля клеток лизировалась. Для этого по вышеприведенной формуле закона Бугера-Ламберта-Бера рассчитывается конечная концентрация эритроцитов в объекте к моменту завершения гемолиза. Зная начальную их концентрацию, можно определить долю лизировавших клеток.

Еще проще оценить степень гемолиза по величинам T. Считая исходное значение светопропускания у исследуемой суспензии эритроцитов (Т_о) соответствующей 0% гемолиза, пропускание образца с полным гемолизом (Т₁₀₀) – соответствующей 100% гемолиза, а конечное значение ее (Т_к) – соответствующей искомым Х% гемолиза, составляем пропорцию и получаем:

Поскольку величина падающего светового потока (J_o) во всех случаях одинакова, эту формулу можно упростить, заменив величины Т на соответствующие величины J_пп:

где J_K – регистрируемая величина прямо проходящего светового потока по завершению гемолиза; J_эс – величина этого светового потока у эритроцитарной суспензии до начала гемолиза, а J₁₀₀ – у полностью лизированной суспензии.

В предлагаемой работе гемолиз будет носить полный (завершенный) характер.

Дата добавления: 2015-07-25