Технология производства лизина.

В организме высших животных и человека определяет биологическую ценность перевариваемого белка. Данная аминокислота выполняет также много других важнейших биохимических функций – способствует секреции пищеварительных ферментов и транспорту кальция в клетки, улучшает общий азотный баланс в организме. Добавление лизина в состав комбикормов увеличивает усвояемость белка животными и снижает расход кормов на производство животноводческой продукции.Синтез L-лизина у микроорганизмов осуществляется различными путями. Дрожжи, грибы и микроводоросли синтезируют лизин из α-кетоглутаровой кислоты через α-аминоадипиновую кислоту. Вследствиемалой изученности этого биосинтетического пути получение мутантов – суперпродуцентов лизина через аминоадипиновый путь представляетсяпроблематичным. Высшие растения и бактерии синтезируют лизин подругой схеме – через α-диаминопемелиновую кислоту. По этой разветвленной схеме биосинтеза L-лизина (диаминопимелиновый путь) синтезначинается с аспарагиновой кислоты и проходит через диаминопимелиновую кислоту. Помимо L- лизина, аспарагиновая кислота является такжепредшественником для L-метионина, L-треонина и L-изолейцинаКлючевым местом в синтезе лизина является аспартаткиназа; она ингибируется треонином. Присутствие лизина этот эффект усиливает.Треонин ингибирует дегидрогеназу полуальдегида аспарагиновой кислоты, а также гомосериндегидрогеназу. Метионин является репрессором поотношению к гомосериндегидрогеназе, а изолейцин ингибирует треониндегидрогеназу. Продукты обмена, угнетающие различные ферменты и участвующие в синтезе лизина, следует вывести из реакции. Именно поэтому для производства L-лизина используют различные ауксотрофныемутанты.Производственные штаммы-продуценты лизина – это ауксотрофныештаммы глутаматпродуцирующих коринебактерий (Corynebacterium glutamaticum, Brevibacterium flavum). Применяют три типа ауксотрофных мутантов: ауксотрофы по гомосерину или треонину с подавленной гомосеринкиназой; метионин- и треонинчувствительные штаммы с существенно сниженной активностью гомосериндегидрогеназы; аналогорезистетныепрототрофные продуценты лизина, устойчивые к треонину и аминоэтицилцистеину, с аспартаткиназой, нечувствительной к согласованному ингибированию лизином и треонином. Получены штаммы, обеспечивающие 40 % конверсию углеродного субстрата в аминокислоту и выходы лизина на сахарах до 40, уксусной кислоте – до 70 г/л.Микробиологический процесс производства лизина аналогичен схеме получения глутаминовой кислоты, однако использование ауксотрофных микроорганизмов требует специального состава питательных сред, которые подбираются индивидуально для каждого штамма. Очень важно также осуществлять на стадии ферментации стабилизацию основных параметров культуры в строгом соответствие с технологическим регламентом данного производства, так как выход лизина зависит от температуры среды, концентрации кислорода, длительности ферментации, дозы и возраста посевного материала. Помимо сахаров (7–12 % по объему), сульфата аммония и фосфатов калия, в среду вносят кукурузный экстракт в качестве источника биологически активных веществ (1.2–1.5 % по содержанию сухих веществ), а также мел и синтетический пеногаситель. Среда должна содержать (в л): 200 мг метионина, 800 мг треонина, 15–20 мкг биотина (при меньших концентрациях биотина синтезируется глутаминовая кислота, при 2.5 мг – молочная кислота, как механизм обратного действия). Соотношение углерода и азота в среде оптимально как 11:1 (при его увеличении выход лизина падает, при уменьшении – накапливается аланин).Культивирование осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре в аппаратах объемом 50 и 100 м3 при коэффициенте заполнения 0.75. Процесс длится 48–72 ч при 29–30°С, контролируемом рН 7.0–7.5, непрерывном перемешивании и избыточном давлении 20–30 кПа. Уровень аэрации составляет 1м3 воздуха/м3 среды в минуту. При ухудшении условий аэрации происходит образование молочной кислоты. Для пеногашения используют кашалотовый жир или синтетические масла (0.5 % от объема среды). В первые сутки потребляется около 25 % сахаров и почти все аминокислоты, при этом образуется практически вся биомасса. Далее на фоне резкого снижения скорости роста клеток наблюдается самая высокая скорость синтеза лизина (до 1.0 г/л ч). Для стабилизации рН периодически проводят поддтитровку культуры 25 % раствором аммиака. При дополнительном дробном введении в аппарат углеводов и азота выход лизина можно повысить. Конечная концентрация кислоты достигает 40 г/л при остаточной концентрации сахаров около 0.5–1.0 г/л.Эффективный процесс получения лизина реализован на более доступном субстрате – уксусной кислоте. Токсичность данного субстрата делает необходимой дробную подачу ацетата; его концентрация в среде не должна превышать 2 %. Небольшие добавки сахара в среду (около 1 %) повышают выход лизина на 30–50 %. Экономический коэффициент по потребляемому ацетату при этом составляет 27 %. Конечная концентрация лизина в среде достигает 40–50 г/л. В последние годы получены мутантные штаммы B. flavum, обеспечивающие на ацетатной среде выход лизина до 73 г/л.Практически весь производимый микробиологическим способом L лизин используется в кормопроизводстве для повышения усвояемости и питательности кормов. Поэтому выпускается лизин, главным образом, в виде кормовых препаратов – жидкого концентрата лизина (ЖКЛ) и кормового концентрата лизина (ККЛ).При производстве ЖКЛ культуральную жидкость, предварительно стабилизированную 25 % раствором гидросульфита натрия, подкисляют соляной кислотой до рН 4.5–5.0. Образующийся при этом термостабильный монохлорид лизина упаривают в вакуумно-выпарных аппаратах до 40 % содержания сухих веществ. Готовый препарат ЖКЛ не замерзает при температуре до –18°C и сохраняет свои свойства в течение 3 месяцев.ККЛ получают на основе ЖКЛ, высушивая жидкий концентрат в распылительных сушилках при температуре не более 90°С до остаточной влажности 4–8 %. Сухой препарат лизина гигроскопичен и в процессе хранения подвержен порче. Для устранения данного нежелательного явления в концентрат перед высушиванием вводят наполнители в виде костной муки, бентоита, негашеной извести, пшеничных отрубей. Высушивание полученной пасты проводят конвективным способом на вальцево ленточных сушилках. Препарат по составу близок к жидкому концентрату лизина и содержит (в %): 7–10 лизина, 15–17 белка, до 14 других амино кислот, 10–13 бетаина и 20–25 зольных веществ. Препарат сыпуч и негигроскопичен. Срок его хранения возрастает до 1 года.

3. Схема производства лизина.

Микробиологический синтез лизина осуществляют мутантные штаммы бактерий, относящиеся к родам Corynebacterium и Brevibacterlum. Как правило, они проявляют дефицит к одной из аминокислот: гомосерииу, треонину, изолейцину, метионину или их сочетанию, а также биотину и тиамину. На рис. 1 приведе­на схема биосинтеза лизина из аспарагиновой кислоты. Помимо этого пути эукариотные организмы имеют еще один путь синтеза лизина — через α-аминоадиииновую кислоту. В соответствии со схемой для биосинтеза лизина и его накопления необходимо создать такие условия, при которых будет ограничен синтез аланина, глутаминовой и молочной кислот, но интенсифицирован синтез аспарагиновой кислоты. Биохимический механизм регуля­ции синтеза лизина основан на принципе отрицательной обрат­ной связи. Согласно этому принципу, как известно, избыток ко нечного продукта реакции ингибирует собственный синтез. В од­ном случае подавляется активность одного или ряда ферментов, происходит явление ретроингибирования, связанное с аллостери-ческим эффектом. В другом — прекращается синтез самого фер­мента, происходит репрессия. Отсюда очевидно, что наличие в среде ряда аминокислот должно быть в строго ограниченном количестве, достаточном только для роста культуры. Узловым ферментом в синтезе лизина является аспартаткиназа. Угнетают ее активность лизин и треонин при их совместном действии, так как аспартаткиназа представляет собой мультивалентный фер­мент. Треонин ингибирует у С. glutamicum дегидрогеназу полу­альдегида аспарагиновой кислоты и гомосериндегидрогеиазу.

Метионин по отношению к гомосериндегидрогеназе является репрессором. Изолейцин ингибирует треониндегидрогеназу. Сле­довательно, продукты обмена веществ, ингибирующие различ­ные ферменты, участвующие в синтезе лизина, должны быть выведены из сферы реакции. Именно поэтому мутантные штаммы микроорганизмов наиболее удобны для производства. Так, штам­мы, лишенные активности гомосериндегидрогеназы, обеспечивают достаточно высокие выходы лизина.

Аминокислоты, необходимые для роста микроорганизмов, вно­сят со средой. Они обычно содержатся в природных продуктах, например в мелассе. Но их количество должно контролироваться, чтобы не были созданы условия, при которых аминокислоты вы­ступают в качестве регуляторов процесса. Одним из компонентов среды, оказывающим влияние на ход биосинтеза аминокислот, является фосфор (в виде фосфата). Так, при увеличении опти­мальной для накопления лизина концентрации фосфора в десять раз количество лизина снижается на 40 %, а содержание других аминокислот, особенно валина, значительно увеличиваются.

При изучении механизмов регуляции образования целевых продуктов преимущественное внимание обычно обращают на ко­нечные этапы биосинтеза, как это было показано выше на приме­ре лизина. Но важно знать и весь путь биосинтеза с точки зрения оценки ферментативной активности всех реально функционирую­щих систем. Интерес может представлять соотношение количеств глюкозы, включающихся в обмен по фруктозобисфосфатному пути или через гексозомонофосфатный путь. Последний путь способен обеспечить процесс большим количеством восстановлен­ной формы никотинамиддинуклеотид (фосфат) а, а также синтез продуктов, образующихся через шикимовую кислоту.

Применительно к механизму синтеза лизина несомненный интерес имеет функция цикла трикарбоновых кислот. Известно, что синтез лизина проходит через ЦТК, далее — через аспарагиновую кислоту после аминирования щавелевоуксусной и ее фосфорилированное производное. Поэтому вполне закономерен во­прос о коррелятивных взаимоотношениях величин активности ферментов брожения, ЦТК и синтезом лизина. В непосредствен­ной связи с этим вопросом находится представление о влиянии концентрации источника углерода на синтез лизина. Показано, что при увеличении концентрации углеводов в среде в культуре Brevibacteriutn sp. выше некоей эмпирически установленной оп­тимальной величины, удлиняется лаг-фаза, увеличивается удель­ная скорость роста в экспоненциальной фазе, но снижается вы­ход лизина и изменяется активность ферментов пути Эмбдена — Мейергофа — Парнаса и ЦТК. Следует отметить, что оптималь­ная для синтеза лизина концентрация углеводов не является постоянной. Она зависит от многих показателей, в частности от интенсивности перемешивания среды. Максимальная лизин-синтезирующая активность продуцента Brevibacteriutn sp. обыч­но наблюдается при высокой активности ферментов ЦТК.

Одним из способов получения лизина является ферментатив­ный метод, при котором субстратом служит мезоизомер 2,6-диаминопимелиновой кислоты, а фермент – диаминопимелинат-декарбоксилаза. Практически используют суспензию микробных клеток, в частности Brevibacteriutn sp., предварительно выращен­ных на соответствующей среде. Иногда микробные клетки пред­варительно обрабатывают ацетоном для получения «ацетонового порошка».

Предложено также несколько технологических способов пере­вода L,L-2,6-диaминoпимeлинoвoй кислоты в мезоформу (напри­мер, тепловая обработка при 200°С, пропускание через сульфо-катионит в Н-форме и др.).

Разработаны методы культивирования Brevlbacteriutn sp., обеспечивающие высокую декарбоксилазную активность, уча­ствующую в синтезе лизина. Наибольшая удельная активность фермента на полусинтетической среде наблюдается через 18— 20 ч роста культур, т. е. в конце экспоненциальной фазы, на мелассной — в середине экспоненциальной фазы роста.

Показана, кроме того, возможность конверсии Чв лизин DL-α-амино-ε-капролактама. Для осуществления процесса первона­чально путем химических реакций получают из циклогексана DL-α-амино-ε-капролактам, который на стадии ферментативного гид­ролиза превращается в L-лизин. При этом происходит разделение оптических изомеров (наиболее сложный и дорогостоящий этап синтеза всех L-аминокислот). Этот процесс предполагает участие двух ферментативных реакций, а именно рацемизацию DL-α-амино-ε-капролактама и гидролиз L-аминолактама:

Продуцентами гидролазы а-амино-е-капролактама служат некоторые штаммы дрожжей, относящиеся к родам Cryptococ-cus, Candida, Trlchosporon. Культивирование их ведется в аэроб­ных условиях при 20 – 40 °С и рН 6 – 10 на среде, содержащей глюкозу и соль аммония. В среде непременно должен также при­сутствовать DL-α-амино-ε-капролактам (или его L-изомер).

Источником фермента для осуществления технологического процесса гидролиза могут служить: биомасса, собранная сразу после культивирования, клетки, обработанные ацетоном, клетки после сублимационной сушки, клеточный экстракт и очищенный фермент L-α амино-ε-капролактамгидролаза. Реакция проходит в щелочной среде при 40—50 °С, при более высокой температуре активность падает. Активаторами фермента являются ионы Mn²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺. По окоиачании процесса полученный L-лизин извлекают из реакционной смеси каким-либо известным спосо­бом. Оставшийся D-α-амин-ε-капролактам подвергается раце­мизации.

Источником рацемаз могут быть бактерии, относящиеся к родам Achromobacter, Flavobacterium и некоторым другим. Не­пременным компонентом среды для их выращивания, как и в предыдущем случае, служит DL-a-амино-е-капролактам или его хлоргидрат. Принцип действия фермента, по-видимому, иденти­чен действию рацемаз аминокислот, требующих в качестве ко­фактора пиридоксаль-5'-фосфат.

При получении L-лизина целесообразно совместное действие на субстрат двух ферментов. Для этого в водный раствор DL-α-амино-ε-капролактама вводят необходимое количество дрожже­вых и бактериальных клеток, проявляющих гидролазную и рацемазную активности. Для совместного действия двух ферментов наиболее благоприятны рН среды 8,0—8,5, температура 30 – 50 °С. В результате реакции. DL-α-амино-ε-капролактам количе­ственно переходит в L-лизии. Рассмотренный способ синтеза L-лизина интересен тем, что указанные ферменты можно полу­чить в иммобилизованной форме.

Список использованной литературы

1. Быков В. А., Крылов И. А., Манаков М. Н., Марквичев Н. С., Орлова Л. М., Тарасова Н. В. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. – М.: Высшая школа, 1987. 143с.

2. \\wikipedia.tomsk.ru

3. Егорова Н.С. Промышленная микробиология. – М.: Высшая школа, 1989. 688с.

Дата добавления: 2015-07-25