Процедура

1. Поместите покровное стекло ровно на середину гемоцитометра.

РИСУНОК. Подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Клетки загружаются в обе камеры гемоцитометра с каждой стороны центрального желобка (а). При осмотре стекла с помощью 10Х объектива (общее увеличение 100Х), каждый 1 мм квадрат решетки будет занимать все поле зрения. Каждый 1 мм квадрат разделен на 25 более мелких квадратов (b). Каждый из 25 квадратов разделен на 16 мелких квадратиков, для облегчения подсчета мелких клеток или небольшого числа клеток (с). Для вычисления количества клеток на мл используется результат подсчета количества клеток в 1 мм квадрате.

Плохое суспензирование и недостаточное перемешивание образца перед помещением в камеру является основной причиной ошибок при подсчете клеток с помощью гемоцитометра.

2. Перенесите 500 мкл клеток и среды в микроцентрифужную пробирку. Если объем образца небольшой, возьмите 200 мкл.

3. Перенесите в микроцентрифужную пробирку 200 мкл взвеси клеток и 200 мкл трипанового синего. Закройте пробирку и перемешайте.

4. Отберите 50 мкл смеси клеток с трипановым синим с помощью пипеточного дозатора. Добавьте 20 мкл с каждой стороны покровного стекла, позволяя капле, образовавшейся на кончике пипетки, проникнуть под стекло под действием капиллярных сил. (Если у вас два различных образца, можно аккуратно поместить по одному с каждой стороны.) Заполните оба отсека камеры, даже если у вас только один образец, иначе подсчет может оказаться неточным.

Если вы насчитываете менее 30 клеток, вы можете увеличить концентрацию образца с помощью центрифугирования аликвоты и повторного разведения в меньшем объеме, но обычно этого можно не делать. Проведите три независимых подсчета, чтобы более точно оценить количество клеток.

5. Немедленно поместите гемоцитометр под микроскоп и под малым увеличением наведите его на решетку гемоцитометра. Проведите подсчет в любой 1 мм² области, поэтому сдвиньте поле зрения к углу и переведите микроскоп под большее увеличение, чтобы одна решетка полностью заняла все поле зрения. Вы можете проводить подсчет и под малым увеличением, но при этом сложнее отличать мертвые клетки от живых. Если вы используете инвертированный микроскоп, поднимите объектив, чтобы на образец падало больше света – это существенно улучшит картину.

Чтобы не сосчитать одну и ту же клетку дважды, считайте только клетки, которые находятся наверху и слева от линий в каждом квадрате, и не считайте клетки, лежащие справа и снизу от линий в каждом квадрате. Единообразный подсчет, который каждый раз проводится одинаковым способом, единственный способ получить воспроизводимые результаты.

6. Грубо подсчитайте клетки в 1 мм области, состоящей из 25 квадратов, чтобы понять, требуется ли увеличить или уменьшить концентрацию клеток. В идеале, в 1 мм должно находится от 30 до 300 клеток. Если клеток больше, приготовьте разведение 1:5 или 1:10.

7. Подсчитайте живые клетки в 1 мм квадрате. Мертвые клетки будут окрашены в синий цвет, а живые клетки окрашены не будут (хотя могут иметь голубое кольцо или выглядеть зернистыми). Удобно пользоваться двухканальным счетчиком, так чтобы можно было одновременно считать мертвые и живые клетки, и получить процент живых клеток.

Если результаты подсчета сильно отличаются друг от друга, скажем, более чем на 20%, это может говорить о недостаточно качественном разведении клеток или образовании кластеров клеток.

8. Подсчитайте суммарное количество клеток в трех различных 1 мм квадратах и разделите его на 3, чтобы получить среднее значение количества клеток в 1 мм квадрате.

9. Вычислите количество клеток в 1 мл. Среднее количество клеток в 1 мм квадрате Х 10,000 Х разведение образца = количеству клеток в 1 мл исходного образца.

Пример:

Результаты вашего подсчета составили 113, 99 и 118 (среднее значение 110).

110 Х 10,000 = 1,1 Х 10⁶ клеток/мл

Если вы смешали 200 мкл клеток с 200 мкл трипанового синего, степень разведения равна 2.

2 Х 1,1 = 2,2 Х 10⁶

2,2 Х 10⁶ клеток/мл соответствует количеству клеток в исходной культуре.

10. Вычислите процент живых клеток в исходной культуре. Разделите количество живых клеток в трех 1 мм квадратах на общее число живых и мертвых клеток в трех 1 мм квадратах и умножьте на 100.

Показатель жизнеспособности меньший, чем 80-90% указывает на больную популяцию клеток. Чаще всего это говорит об избыточной плотности культуры, о повреждении клеток, но также может указывать на заражение или некачественную среду или сыворотку.

Делаем выводы и записываем в тетрадь:

Дата добавления: 2015-07-25