Повреждающее действие пероксида водорода на

клетку (перитонеальный макрофаг)

(Практическая часть занятия)

Цель опыта: приобрести навыки выделения и работы с первичной культурой клеток. Изучить влияние повреждающего действия активных форм кислорода на мембранные структуры клетки.

Приборы и материалы: 1 мышь весом 15-20 гр., лоток, бикс, препаровальный столик, булавки, ножницы глазные, пинцет анатомический, шприц инсулиновый, шприц 5 мл, камера Горяева, микроскоп, пипетки лабораторные, штативы пробирочные и для эппендорфов, эппендорфы, маркер.

Реактивы: физиологический раствор, хлоралгидрат из расчета 35 мг/100 г веса, синь трепановая, пероксид водорода 3%, бензоат натрия.

Ход работы:

1. Наркотизируем мышь.

Для этого берем мышь большим и указательным пальцами за хвост, ближе к основанию и сажаем ее на клетку или ровную поверхность. Прижимаем мышь безымянным пальцем, приподнимаем хвост и делаем укол инсулиновым шприцом (0,1 мл р-ра хлоралгидрата) в нижнюю часть живота, стараясь не проникать иглой глубоко.

2. Закрепляем мышь на препаровальном столе булавками. Пинцетом аккуратно подхватываем и приподнимаем шкурку немного ниже грудины.

3. Ножницами делаем надрез и аккуратно удаляем волосистый покров с брюшка.	4. Прокалываем иглой (5 мл шприца) брюшину и вводим 5 мл физ. раствора, не вынимая иглу.

5. Массируем пальцами брюшную полость в течение 1,5-2 минут.	6. Откачиваем шприцом жидкость.

7. Собранную взвесь клеток центрифугируем 4 мин при 1000 оборотов/мин

8. Удаляем надосадочную жидкость пипеткой, доводим объем до 1 мл физ раствором, затем пипетируем (взбалтываем пипеткой) взвесь клеток. Эта взвесь клеток представляет собой ПЕРВИЧНУЮ КУЛЬТУРУ КЛЕТОК.

9. Помечаем эппендорфы: контроль 1/1 как «К1/1», контроль 2/1 как «К2/1», пероксид водорода 1/1 как «ПВ1/1» и пероксид водорода 2/1 как «ПВ2/1». Собираем камеру Горяева.

10. Отливаем пипеткой 100 мкл взвеси клеток в эппендорф с пометкой контроль 1/1, добавляем 100 мкл раствора бензоата натрия и ждем 2 минуты. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева (См. ПРОТОКОЛ ниже). Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток. Результаты записываем в тетрадь.

11. Отливаем пипеткой 67 мкл взвеси клеток в эппендорф с пометкой контроль 2/1, добавляем 134 мкл раствора бензоата натрия и ждем 2 минуты. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток. Результаты записываем в тетради.

12. В третий эппендорф с пометкой пероксид водорода 1/1 наливаем 100 мкл взвеси клеток+ 100мкл р-ра пероксида водорода, ждем 2 минуты. Таким образом, на клетки действует 1.5% пероксида водорода. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток и отмечает соотношение прокрашенных и непрокрашенных клеток. Результаты записываем в тетрадь.

13. В четвертый эппендорф с пометкой пероксид водорода 2/1наливаем 67 мкл взвеси клеток+ 134 мкл р-ра перекиси водорода, ждем 2 минуты. Таким образом, на клетки действует 2% пероксида водорода. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток и отмечает соотношение прокрашенных и непрокрашенных клеток. Результаты записываем в тетрадь.

Нормальные макрофаги (указано стрелкой) Поврежденные макрофаги (указано стрелкой)

ПРОТОКОЛ «Микроскопический подсчет живых клеток»

В образец клеток добавляется трипановый синий, краситель, который не проникает в живые клетки, но окрашивает мертвые клетки в темно-синий цвет. Затем клетки помещаются на специальное стекло с нанесенной решеткой, которое называется гемоцитометр (или камера Горяева), и количество клеток подсчитывается вручную под микроскопом.

Дата добавления: 2015-07-25