Задача 3. Описать тканевые культуры для культивирования вирусов.

Для этого надо знать:

1. Бывают культуры растущих тканей и переживающих тканей (утративших способность к росту), которые выращивают в жидкой среде или с плотным покрытием.

2. В зависимости от техники изготовления существуют три основных типа растущих тканевых культур:

а) однослойныетканевые культуры – клетки прикрепляются и растут в виде сплошного монослоя, стелющегося по поверхности стекла лабораторной посуды;

б) культуры суспензированных клеток – клетки растут и размножаются во взвешенном состоянии при интенсивном перемешивании среды; их используют для большого накопления вирусов;

в) органные культуры или культуры фиксированных кусочков - кусочки органов животных и человека, выращиваемых вне организма и сохраняющие свойственную им структуру.

3. Однослойные культуры – основные культуры, используемые в современной лабораторной и производственной вирусологической практике. По числу жизнеспособных генераций они подразделяются на:

а) первичные (первично-трипсинизированные) – клетки этой культуры используются в течение одной генерации, т.е. каждый раз необходимо вновь получать культуру ткани; культуру готовят путем измельчения ткани, разъединения клеток при обработке тканей трипсином, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их размножение; при оседании клетки ткани легко и довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, на которой растут и распространяются в виде монослоя; чаще всего используют эмбриональные ткани (клетки типа фибробластов, почечная ткань эмбриона человека и обезьян, амниона человека, фибробласты куриного эмбриона, эмбриона мыши), а также ткани взрослого человека нормального или опухолевого происхождения;

б) перевиваемые – эти культуры можно поддерживать путем непрерывных перевивок, т.к. клетки хорошо адаптированы к условиям постоянного существования in vitro; их готовят из линий клеток, которые хорошо размножаются в течение многих лет; чаще всего эти культуры получают из опухолевых клеток. Получено около 200 штаммов таких клеток: штамм L (из культуры мышиных фибробластов), штамм HeLa (из карциномы шейки матки), штамм Hep-3 (из лимфоидной карциномы) и т.д. Работа по получению этих культур менее трудоемка, клетки их одинаковы и стабильны в своих свойствах; они способны размножаться в течение длительного срока в лабораторных условиях и сохранять свои свойства в замороженном состоянии (t° = -70° C) в течение многих лет;

Первичные и перевиваемые линии клеточных культур могут быть контаминированы микоплазмами и неизвестными вирусами, среди которых встречаются онкогенные (вирус SV40 в культуре почечных клеток обезьян). Возможность внесения в организм человека вместе с вакциной онкогенных вирусов резко ограничивает использование перевиваемых линий клеточных культур в производстве вирусных вакцин и требует проведения соответствующих контролей.

в) полуперевиваемые – клетки этих культур способны размножаться в течение 50 пассажей (перевивок), сохраняя исходный диплоидный набор, типичный для соматических клеток используемых тканей; для их приготовления используют диплоидные клетки человека (фибробласты человеческого эмбриона, диплоидные клетки легких человека). Диплоидные клетки не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых; они нашли широкое применение в вирусологии, особенно в производстве вакцин.

3. Для выращивания клеточных культур необходимы клеточные среды сложного состава (минеральные соли, глюкоза, аминокислоты, витамины, кофакторы; вносят сыворотку крови и буферные растворы, антибиотики для предотвращения бактериального загрязнения). К ним относятся среда 199, среда Игла, среда Тироде.

4. Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики во избежание заноса в них различных микроорганизмов из окружающей среды. Для предотвращения загрязнения культуры бактериальной флорой к ней добавляют антибиотики (пенициллин, стрептомицин).

5. После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток, которая начинает расти и размножаться, и изучения ее под микроскопом (´8) культуру заражают 1 мл вируссодержащего материала. Пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой и в наклонном положении помещают в термостат при 37° С на 5-7 суток.

Дата добавления: 2015-07-25