Экспериментальные исследования

2.2.1 Получение коллоидного золота с заданным размером
по методу Френса

Синтез наночастиц коллоидного золота проводили по методу Френса. Для постановки метода использовали 10% раствор золотохлористоводородной кислоты, 1% цитрата натрия, деионизированную воду.

Приготовление 10% раствора золотохлористоводородной кислоты.
К 1 г HAuCl₄ добавляли 10 мл деионизированной воды.

Приготовление 1% цитрата натрия. 1 М (Na₃C₆H₅O₇×5,5H₂O) = 357 г/моль, 1 М (Na₃C₆H₅O₇) = 258 г/моль. 1 М (Na₃C₆H₅O₇)/1 М (Na₃C₆H₅O₇×5,5H₂O) = 0,723. 1 г (Na₃C₆H₅O₇)/0,723 = 1,38 г.

Таким образом, для приготовления 100 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия необходимо взвесить 1,38 г вещества и добавить 100 мл деионизированной воды.

Анализ данных литературы показал, что точной методики получения наночастиц КЗ определенного размера до настоящего времени не существует.

Одним из основных критериев, используемых для получения наночастиц коллоидного золота определенного размера, по данным литературы, является объем добавляемого цитрата натрия. Однако в отношении соответствующего параметра по данным литературы имеются расхождения. Так, в одних источниках представлены экспериментальные данные, где указан необходимый объем цитрата натрия, который использовали в соответствующей работе для получения частиц определенного размера. Например, для получения наночастиц коллоидного золота размером 30 нм к 50 мл деионизированной воды необходимо добавить 0,72 мл 1% цитрата натрия [1]. В других источниках представлена формула, по которой можно рассчитать объем цитрата натрия, который необходимо добавить в раствор, чтобы получить определенный диаметр наночастиц КЗ (рис. 2).

Рис. 2 – Формула расчета объема цитрата натрия (V, мл), необходимого для получения определенного диаметра наночастиц КЗ (d, нм) в расчете на 100 мл золя [8].

По данной формуле для получения 50 мл раствора наночастиц КЗ диаметром 30 нм требуется использовать 0,66 мл 1% цитрата натрия.

Кроме этого, анализ научных исследований, проведенных в аналитическом разделе, показал, что также варьируют условия приготовления КЗ.

Например, имеются расхождения по этапности добавления 10% раствора золотохлористоводородной кислоты. В одних источниках 10% раствор хлористоводородной кислоты для получения 1% раствора добавляют сразу в холодную деионизированную воду, в других в подогретую, в третьих при ее закипании [1, 6]. При добавлении золотохлористоводородной кислоты в горячую воду отсутствует временной интервал между ее внесением в деионизированную воду и последующим добавлением 1% цитрата натрия [1].

Разные данные представлены в литературных источниках по количеству оборотов, устанавливаемых на мешалке при варке коллоидного золота, длительности кипячения раствора коллоидного золота после появления красной окраски, необходимому для стабилизации наночастиц [14].

В связи с отсутствием по данным литературы четких рекомендаций по приготовлению коллоидного золота, одной из задач данной дипломной работы явилась отработка методики получения наночастиц коллоидного золота с размером 30 нм с целью последующего их использования для разработки иммунохроматографических тест-систем.

На первом этапе оценили влияние оборотов мешалки на процесс получения частиц и времени кипячения с момента появления красной окраски до окончания эксперимента, необходимого для стабилизации наночастиц КЗ (таблица 1).

При этом для приготовления 50 мл препарата коллоидного золота в колбу наливали 49,23 мл деионизированной воды, сразу в холодную воду добавляли 0,05 мл 10% хлористоводородной кислоты, получая, таким образом, 1% раствор. Колбу с раствором ставили на подогреваемую мешалку, на которой устанавливали обороты – 375 об/мин и температуру – 300 ^оС. Сразу же на колбу надевали обратный холодильник. Через 3 мин 40 при появлении видимых признаков закипания, поднимали холодильник, вносили 0,72 мл 1% цитрата натрия. Сразу же после этого опускали холодильник, закрывая отверстие колбы и предотвращая, тем самым, испарение жидкости с целью сохранения ее постоянного объема. Далее следили за изменением окраски раствора с синей на красную. Вышеуказанные параметры были одинаковыми при приготовлении серий коллоидного золота № 4-6 до момента изменения цвета раствора на красный. Далее условия для различных серий менялись. Для серий № 4, 5, 6 устанавливали на мешалке 500 об/мин и кипятили раствор после появления красной окраски в течение, соответственно, 10, 20 и 30 мин; для серий № 4/1, 5/1, 6/1 – 1000 об/мин и кипятили раствор после появления красной окраски в течение, соответственно, 10, 20 и 30 мин.

Таблица 1 – Сравнительная оценка результатов первого этапа экспериментальных исследований по получению наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм (серии №4-6)

Условия для проведения эксперимента	№ серии коллоидного золота
	4/1		5/1		6/1
Количество воды, мл	49,23	49,23	49,23	49,23	49,23	49,23
Количество внесенного золота, мл 10 %	0,050	0,050	0,050	0,050	0,050	0,050
1%	-	-	-	-	-	-
Количество цитрата натрия, мл; [90]	0,72	0,72	0,72	0,72	0,72	0,72
Условия внесения золота; [6]	В холодную воду	В холодную воду	В холодную воду	В холодную воду	В холодную воду	В холодную воду
Время до появления первых признаков закипания для внесения цитрата натрия	3 мин 40 с	3 мин 40 с	3 мин 40 с	3 мин 40 с	3 мин 40 с	3 мин 40 с
Обороты мешалки в начале эксперимента, об/мин; [1]
Обороты мешалки с момента появления красной окраски до окончания эксперимента, об/мин; [1]
Температура в начале эксперимента, ^оС; [1]
Температура с момента появления красной окраски до окончания эксперимента, ^оС; [1]
Время кипячения, мин:   С момента внесения цитрата до появления синей окраски	1 мин 40 с	1 мин 30 с	1 мин 35 с	1 мин 40 с	1 мин 30 с	2 мин 40 с
От синей окраски до момента появления красной	2 мин	1 мин 50 с	2 мин 10 с	1 мин 45 с	1 мин 50 с	1 мин 10 с
От красной окраски до окончания эксперимента	10 мин	10 мин	20 мин	20 мин	30 мин	30 мин
Общее время кипячения	13 мин 40 с	13 мин 20 с	23 мин 45 с	23 мин 25 с	33 мин 20 с	33 мин 50 с
Диаметр частиц коллоидного золота (dср) по данным результатов электронной микроскопии, нм		11,5			15,5
Форма	Сферическая	Сферическая и овальная	Сферическая	Сферическая и овальная	Сферическая	Сферическая и треугольная
Однородность	Однородные	Неоднородные	Однородные	Однородные	Однородные	Однородные
Наличие конгломератов	Есть, но мало	1 большое скопление	-	Имеются скопления частиц	Есть	Имеются скопления частиц
Результаты спектрофотомии: оптическая плотность (ЕД) max пика поглощения;	0,729	0,760	0,890	0,811	0,780	0,750
длина волны max пика поглощения при измерении в диапазоне λ = 200-600 нм	max при λ=519	max при λ=519	max при λ=522	max при λ=522	max при λ=520	max при λ=520
Диаметр частиц коллоидного золота (dср), определенный по результатам спектрофотометрии [ ]	5-10	5-10	15-20	15-20

В результате проведенного эксперимента в образцах КЗ №4 и 4/1, а также №6 и 6/1 на следующий день наблюдалось небольшое выпадение осадка, вероятно, из-за неадекватного для достижения стабилизации частиц времени кипячения (10 мин и 30 мин). В сериях № 4/1, 5/1, 6/1, при варке коллоидного золота с установленным режимом на мешалке 1000 об/мин, по результатам электронной микроскопии количество конгломератов было несколько больше, чем при режиме 500 об/мин. Лучший результат по данным спектрофотометрии и электронной микроскопии был получен при анализе серии КЗ №5. Оценка внешнего вида содержимого колбы с серией КЗ №5 на вторые сутки показала, что золото не выпало в осадок. По данным спектрофотометрии получено оптимальное соотношение оптической плотности наночастиц КЗ, содержащихся в растворе, и длины волны [..]. Кроме этого, размер частиц в данной серии по результатам электронной микроскопии (17 нм) и спектрофотометрии (15-20 нм) был наиболее близким к ожидаемому (30 нм). Таким образом, для дальнейшей работы были выбраны два условия, отличающие приготовление серий КЗ № 4-6, обороты мешалки (500 об/мин) и время стабилизации частиц после появления красной окраски раствора в процессе варки КЗ (20 мин), при применении которых была получена лучшая серия коллоидного золота – № 5.

Далее мы учли водность раствора золотохлористоводородной кислоты и произвели пересчет ее количества для эксперимента. 1 М (HAuCl₄·3H₂O) = 393,967 г/моль, 1 М (HAuCl₄) = 339,967 г/моль. 1 М (HAuCl₄) / 1 М (HAuCl₄·3H₂O) = 0,863. 1 мл (HAuCl₄) / 0,863 = 1,159 мл. Для получения 10 мл 1% золотохлористоводородной кислоты взяли в 10 раз меньше – 0,1159 мл.

Таким образом, для приготовления 300 мл всех серий золота (№ 8, 8/1, 10, 10/1, 12, 12/1) на втором этапе работы было взято 0,058 мл 10% раствора золотохлористоводородной кислоты.

На втором этапе были отработаны условия внесения раствора золотохлористоводородной кислоты. При приготовлении серий коллоидного золота № 8, 8/1, 10, 10/1 10% золотохлористоводородную кислоту вносили для получения 1% раствора в подогретую воду, после закипания до добавления цитрата натрия раствор кипятили в течение 2 мин. При приготовлении серий коллоидного золота № 12 и 12/1 10% золотохлористоводородную кислоту вносили непосредственно при закипании воды и кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия. Кроме этого, на данном этапе также установили необходимый интервал времени для внесения реагентов относительно появления первых признаков закипания деионизированной воды. Отработка выше указанного критерия связана с отсутствием видимых признаков закипания у деионизированной воды при правильном ее приготовлении […]. Поэтому при варке коллоидного золота ориентировались на время от момента постановки колбы с раствором на плитку до появления и стекания образовавшегося конденсата по стенкам колбы. Было выбрано 2 временных критерия 3 мин (появление конденсата) и 6 мин (активное стекание конденсата) при приготовлении серий № 8, 8/1, 10, 10/1 – для внесения 1% цитрата натрия, при приготовлении серий № 12 и 12/1 – для внесения золотохлористоводородной кислоты. Кроме этого, при прочих равных условиях, при приготовлении коллоидного золота серий № 8 и 8/1, № 10 и 10/1 отличался режим скорости перемешивания растворов в процессе варки: в первом случае – весь период варки золота проводился при 800 об/мин, во втором – 375 об/мин с последующим увеличением до 500 об/мин как это было сделано на первом этапе экспериментальной работы, а при приготовлении серий № 12 и 12/1 во втором случае изменили объем вносимого в раствор 1% цитрата натрия с 0,72 мл на 1,44 мл для того, чтобы убедиться, что изменение объема цитрата натрия, добавляемого к раствору, влияет на диаметр наночастиц.

Сравнительная оценка результатов второго этапа работы по получению наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм, с использованием вышеуказанных условий, представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Сравнительная оценка результатов второго этапа экспериментальных исследований по получению наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм (серии № 8-12)

Условия для проведения эксперимента	№ серии коллоидного золота
	8/1		10/1		12/1
Количество воды, мл	49,23	49,23	49,23	49,23	49,23	49,23
Количество внесенного золота, мл 10 %	0,058	0,058	0,058	0,058	0,058	0,058
1%	-	-	-	-	-	-
Количество цитрата натрия, мл [90]	0,72	0,72	0,72	0,72	0,72	1,44
Условия внесения золота	В подогретую воду, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия [40]	В подогретую воду, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия [40]	В подогретую воду, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия [40]	В подогретую воду, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия [40]	При закипании, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия [1]	При закипании, кипятили 2 мин до добавления цитрата натрия [1]
Время до появления первых признаков закипания для внесения золота или цитрата натрия	3 мин	6 мин	3 мин	6 мин	3 мин	6 мин
Обороты мешалки в начале эксперимента, об/мин; [1]
Обороты мешалки с момента появления красной окраски до окончания эксперимента, об/мин; [1]
Температура в начале эксперимента, ^оС; [1]
Температура с момента появления красной окраски до окончания эксперимента, ^оС; [1]
Время кипячения, мин:   С момента внесения цитрата до появления синей окраски	1 мин	40 с	1 мин 15 с	1 мин 15 с	40 с	40 с
От синей окраски до момента появления красной	50 с	47 с	1 мин 5 с	1 мин 5 с	47 с	47 с
От красной окраски до окончания эксперимента	20 мин	20 мин	20 мин	20 мин	20 мин	20 мин
Общее время кипячения	21 мин 50 с	21 мин 27 с	22 мин 20 с	22 мин 20 с	21 мин 27с	21 мин 27 с
Диаметр частиц коллоидного золота (dср) по данным результатов электронной микроскопии, нм			26,7	26,7
Форма	Разной формы: сферической, овальной, круглой, встречаются треугольной	Очень много частиц многоугольной формы	Овальная, круглая, единичные треугольные	Овальная, круглая	Сферическая, имеются единичные многоугольные частицы	Овальная, круглая
Однородность	Неоднородные	Неоднородные	Однородные	Однородные	Однородные	Однородные
Наличие конгломератов	Есть	Есть	-	-	-	-
Результаты спектрофотометрии: оптическая плотность (ЕД), max пика поглощения;	0,055	0,075	0,785	1,020	0,690	0,867
длина волны max пика поглощения при измерении в диапазоне λ = 200-600 нм	max при λ=530	max при λ=533	max при λ=525	max при λ=526	max при λ=523	max при λ=525
Диаметр частиц коллоидного золота (dср), определенный по результатам спектрофотометрии, нм [ ]		40-50	20-30		15-20	20-30

Из данных, представленных в таблице 2, можно сделать вывод, что золото серии № 8 и 8/1 некондиционно и не может быть использовано для дальнейшей работы. При визуальной оценке серий КЗ № 8 и 8/1 раствор, в котором находятся частицы, имеет синий цвет, по данным электронной микроскопии полученные частицы коллоидного золота неоднородны по форме и размеру, образуют большое количество конгломератов, на графиках, полученных при спектральном анализе наночастиц (рис. 3), отсутствует четко сформированный пик поглощения, невозможно оценить его ширину, что также свидетельствует о неоднородности и плохих дисперсионных свойствах КЗ.

Рис. 3 – График светопоглощения раствора КЗ серии № 8 и 8/1.

Наиболее кондиционными оказались серии № 10, № 10/1, № 12,
№ 12/1. Наночастицы в указанных сериях препаратов по данным электронной микроскопии однородны по форме и размерам. По результатам спектрофотометрии получены равнобедренные спектрофотометрические графики, подтверждающие хороший дисперсионный состав наночастиц. Все серии по размерам частиц (от 15 до 30 нм) получились, в соответствии с данными литературы, пригодными для дальнейшей разработки иммунохроматографических тест-систем. Серию № 10 от серии № 10/1 и серию № 12 от серии № 12/1 отличает большая однородность частиц и оптимальная, близкая к 1 ЕД, оптическая плотность раствора коллоидного золота для серий № 10/1 и 12/1, что по данным литературных источников […] является также одним из критериев кондиционности КЗ и возможности его успешного использования для разработки иммунохроматографических тест-систем.

Таким образом, по результатам второго этапа работы можно сделать вывод, что разница в добавлении золотохлористоводородной кислоты в подогретую или в кипящую воду принципиально не влияет на качество полученных частиц коллоидного золота. По-видимому, оптимальным временем для добавления золотохлористоводородной кислоты (цитрата натрия) следует считать 6 мин (данное время необходимо для появления конденсата и активного стекания его по стенкам колбы). В большей степени на однородность по форме и размерам частиц, а также дисперсионный состав раствора КЗ влияет режим перемешивания. Использование на первом и втором этапе различных режимов перемешивания раствора после появления у него красной окраски (500, 800, 1000 об/мин) показало, что наиболее оптимальным является режим 500 об/мин. При данном режиме перемешивания коллоидного золото не выпадает в осадок при хранении, более однородно по форме и размеру. На размеры полученных частиц, возможно, также влияет изменение соотношения концентраций компонентов реакции (цитрат натрия/золотохлористоводородная кислота). При пересчете с учетом водности объема вносимой в воду хлористоводородной кислоты (с 50 мкл на 58 мкл) при постоянном объеме добавляемого в раствор 1% цитрата натрия
(720 мкл), а также внесение в реакционную смесь большего объема 1% цитрата натрия (1440 мкл при приготовлении серии № 12/1) получены наночастицы большего размера (от 20 до 50 нм), чем на первом этапе работы при приготовлении серий № 4-6.

Исходя из выше изложенного, для дальнейшей оценки кондиционности по адсорбционной способности были отобраны четыре серии коллоидного золота № 10, 10/1, 12, 12/1 с размером частиц, соответственно, 20-30 нм,
30 нм, 15-20 нм, 30 нм.

2.2.2 Постановка реакции для определения «золотого числа»

Обязательным этапом конструирования иммунохротографических тест-систем является определение «золотого числа», т.е. минимального защитного количества гидрофильного полимера, способного адсорбироваться на поверхности 10 мл золя золота и предотвращать его коагуляцию при добавлении к нему 1 мл 10% раствора NaCl. Оценка адсорбционной способности также может характеризовать кондиционность, приготовленных наночастиц коллоидного золота [1].

При постановке реакции использовали серии КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 и МкАт 1811 и 387 («Биалекса», Россия) с концентрацией белка 4,5 мг×см^-3 и 8,0 мг×см^-3 соответственно. Разведения антител и постановку реакции проводили в 96-луночных круглодонных полистероловых планшетах на наиболее часто используемом для этих целей, по данным литературы, 0,005 М карбанатно-бикарбонатном буфере [….].

0,005 М карбанатно-бикарбонатный буфер (КББ) готовили из 0,2 М КББ с рН 9,0-9,5 ЕД.

Приготовление 0,2 М КББ с рН 9,0-9,5 ЕД:

· 1 М (К₂CO₃) = 138,2 г на 1 л – 1 М раствор;

27,64 г на 1 л – 0,2 М раствор;

2,764 г на 100 мл – 0,2 М раствор;

· 1 М (NaHCO₃) = 84 г на 1 л – 1 М раствор;

16,8 г на 1 л – 0,2 М раствор;

1,68 г на 100 мл – 0,2 М раствор;

0,168 г на 10 мл – 0,2 М раствор.

Путем добавления к 0,2 М раствору NaHCO₃ 0,2 М раствора К₂CO₃ получали раствор карбонатно-бикарбонатного буфера с рН 9,5 ЕД.

Из 0,2 М КББ готовили 5 мМ раствор КББ путем разведения 0,2 М раствора КББ в 40 раз: 1 часть 0,2 М КББ (250 мкл) + 39 частей деионизированной воды (9750 мкл).

Все растворы для постановки реакции для определения «золотого числа» фильтровали через шприц-насадку с размером пор 0,22 µ.

Разведение МкАт (1811 и 387) для постановки реакции.

МкАт 1811 с исходной концентрацией 4,5 мг×см^-3 разводили на 0,005 М КББ до 200 мкг×см^-3. Для приготовления 800 мкл антител с концентрацией 200 мг×см^-3, предназначенных для тестирования, 35,55 мкл антител с исходной концентрацией 4,5 мг·см^-3 добавляли к 764,45 мкл 0,2 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,0 ЕД.

МкАт 387 с исходной концентрацией 8,0 мг×см^-3 разводили на 0,005 М КББ до 200 мкг×см^-3. Для приготовления 250 мкл антител с концентрацией 200 мкг×см^-3, предназначенных для тестирования, 6,25 мкл антител с исходной концентрацией 8 мг·см^-3 добавляли к 243,75 мкл 0,2 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,0 ЕД.

Постановка реакции. Для постановки реакции с целью определения золотого числа (ЗЧ) использовали два планшета: планшет № 1 – определение ЗЧ для МкАт 1811, планшет № 2 – определение ЗЧ для МкАт 387. Реакцию с каждой серией КЗ ставили в 2 повторностях. Ниже представлен алгоритм постановки реакции с МкАт 1811 и сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 в планшете № 1:

1. Все серии КЗ доводили 0,2 М К₂CO₃ до рН 9,5 ЕД.

2. Во все лунки восьми горизонтальных рядов 96-луночного круглодонного пиолистеролового планшета вносили по 100 мкл 0,005 М карбонатно-бикарбонатного буфера с pH 9,5 ЕД;

3. В первые лунки планшета (А1-Н1) вносили по 100 мкл раствора МкАт 1811 с концентрацией 200 мкг·см^-3, при этом конечная концентрация антител в лунках А1-Н1 при добавлении их к 100 мкл буфера составила
100 мкг·см^-3;

4. Далее титровали содержимое лунок А1-Н1 слева направо с шагом два путем переноса 100 мкл раствора МкАт из каждой предыдущей лунки в каждую последующую. Таким образом, концентрация МкАт составила в лунке А1 – 100 мкг·см^-3, в А2 – 50 мкг·см^-3, в А3 – 25 мкг·см^-3, в А4 – 12,5 мкг·см^-3, в А5 – 6,25 мкг·см^-3, в А6 – 3,125 мкг·см^-3, в А7 –
1,5 мкг·см^-3 (принята за 0 мкг·см^-3). Аналогичным образом менялась концентрация антител в лунках горизонтальных рядов В-Н.

5. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в 2-х повторностях) вносили по 100 мкл КЗ, не задевая носиком содержимое лунок: в лунки рядов А-В – КЗ №10, С-D – №10/1; E-F – 12; G-H – №12/1;

6. Содержимое лунок инкубировали 15 мин;

7. По окончанию инкубации в каждую лунку вносили по 22 мкл 10%-ного раствора натрия хлорида. Конечная концентрация NaCl в каждой лунке при этом составила 1%;

8. Содержимое лунок перемешивали справа налево;

9. Инкубировали 10 мин.

Аналогичным образом проводили постановку реакции в планшете № 2 с МкАт 387.

Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре.

При визуальной оценке за «золотое число» принимали концентрацию антител в лунке, имеющей стабильную розовую окраску (где отсутствовало изменение цвета с розового на голубой-синий).

Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1 представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты визуальной оценки реакции определения ЗЧ для МкАт 1811 и 387 с сериями КЗ № 10, 10/1, 12, 12/1.

Серия КЗ	Золотое число для МкАТ 1811 / 387 определено в лунке (1) и соответствует концентрации МкАт (2), мкг·см^-3
		3,125		12,5
10/1		6,25		25,0
		3,125		12,5
12/1		6,25		25,0

Кроме визуального определения «золотого числа» оценивали оптическую плотность содержимого лунок на планшетном спектрофотометре, измеряя ее при длине волны λ = 630 нм. По результатам определения строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител.

На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см^-3).

концентрация МкАТ, мкг·см^-3

Рис. 1 – Результаты определения «золотого числа» для МкАт 387 и 1811 с серией КЗ № 10/1 при постановке реакции на 0,005 М КББ.

Из данных, представленных на рисунке 1, следует, что точка выхода на плато соответствует концентрация МкАт: для МкАт 1811 – 3,125 мкг·см^-3 , для МкАТ 387 – 12,5 мкг·см^-3.

По результатам визуальной оценки и спектрофотометрии были определены серии КЗ с наибольшей адсорбционной способностью – №10/1 и 12/1, а также выбраны МкАт 387 для последующей посадки на наночастицы КЗ соответствующих серий препаратов.

Для МкАт 387 был выбран диапазон концентраций антител от
25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3 , в пределах которого провели раститровку антител с шагом 2 мкг·см^-3 с целью определения более точного значения концентрации антител для приготовления конъюгата с КЗ.

Приготовление концентраций МкАт отличающихся друг от друга на
2 мкг·см^-3 в диапазоне от 25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3 проводили в эппендорфах в объеме, необходимом для постановки реакции с сериями КЗ № 10/1 и 12/1. Для этого:

а) готовили необходимый объем раствора МкАт с концентрацией
25 мкг·см^-3. Для этого к 15,625 мкл раствора МкАТ с исходной концентрацией 8 мкг·см^-3 добавляли 4984,375 мкл 0,005 М КББ;

б) в первый эппендорф вносили 450 мкл, а в остальные 9 по 400 мкл раствора МкАТ с концентрацией 25 мкг·см^-3;

в) для получения концентрации антител 23, 21, 19, 17, 15, 13, 11, 9, 7 мкг·см^-3 , начиная со 2-го эппендорфа, вносили 0,005 М КББ в объеме 36, 76, 128, 188, 268, 368, 508, 712, 1028 мкл, соответственно.

Далее проводили постановку реакции с целью определения «золотого числа» в планшетах:

1. Вносили в лунки А1-D1 первого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 25 мкг·см^-3, в лунки А2-D2 второго вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 23 мкг·см^-3 , в лунки А3-D3 третьего вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 21 мкг·см^-3 , в лунки А4-D4 четвертого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 19 мкг·см^-3, в лунки А5-D5 пятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 17 мкг·см^-3, в лунки А6-D6 шестого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 15 мкг·см^-3 , в лунки А7-D7 седьмого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 13 мкг·см^-3; в лунки А8-D8 восьмого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 11 мкг·см^-3, в лунки А9-D9 девятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 9 мкг·см^-3 , в лунки А10-D10 десятого вертикального ряда по 100 мкл МкАт с концентрацией 7 мкг·см^-3.

2. В каждую лунку двух горизонтальных рядов (в 2-х повторностях) вносили по 100 мкл КЗ, не задевая носиком содержимое лунок: в лунки рядов А-В – КЗ 10/1, С-D – 12/1.

3. Содержимое лунок инкубировали 15 мин.

4. По окончанию инкубации в каждую лунку вносили по 22 мкл 10%-ного раствора натрия хлорида. Конечная концентрация NaCl в каждой лунке при этом составила 1%.

5. Содержимое лунок перемешивали справа-налево.

6. Инкубировали 10 мин.

Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре, измеряя спектр содержимого лунок планшета при длине волны λ = 630 нм.

По результатам спектрофотометрии строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител. На графике определяли точку выхода на плато (х мкг·см^-3). Золотое число определяли как х + 15% [87].

концентрация МкАТ, мкг·см^-3

Рис. 2 – Зависимость спектра поглощения от концентрации МкАТ при длине волны 630 нм при титровании антител в диапазоне от 25 мкг·см^-3 до 12,5 мкг·см^-3 с интервалом 2 мкг·см^-3.

Из данных, представленных на рисунке 2, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует
19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы [87] необходимая концентрация для конъюгации соответствующих антител должна составлять плюс 15 % к концентрации, определенной по результатам оценки «золотого числа», соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

2.2.3 Результаты экспериментального обоснования состава
конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки
иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для
идентификации Helicobacter pylori

В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально отработана методика приготовления наночастиц КЗ с диаметром 30 нм.

Для получения кондиционного коллоидного золота с размером частиц 30 нм необходимо:

1) приготовить 50 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия: 0,69 г 5,5-водного цитрата натрия растворить в 50 мл деионизированной воды;

2) приготовить 10% раствор золохлористоводородной кислоты (HAuCl₄·3H₂O): к 1 г HAuCl₄ добавить 10 мл деионизированной воды;

3) в колбу Эрленмейера добавить 50 мл деионизированной воды и поместить магнитную мешалку. Надеть на колбу обратный холодильник, поставить колбу с содержимым на магнитную плитку и установить на плитке режим 375 об/мин и температуру 300^◦С;

4) через 6 мин (по отработанной в дипломной работе методике – время от момента постановки колбы с содержимым на плитку до начала стекания конденсата) внести 0,058 мл 10% раствора КЗ [1], кипятить 2 мин;

5) внести 0,72 мл 1% раствора 5,5-водного цитрата натрия;

6) при изменении цвета раствора с синего на красный изменить режим на магнитной плитке на 500 об/мин и снизить температуру до 200 ^◦С;

7) кипятить раствор еще 20 мин;

8) выключить магнитную плитку, снять обратный холодильник, остудить раствор при комнатной температуре и оставить до следующего дня с целью оценки на наличие осадка. Хранить в холодильнике при 4 ^оС.

С использованием описанной выше и отработанной по результатам данной работы методики для дальнейшего применения с целью разработки иммунохроматографической тест-системы для выявления H.pylori рекомендованы серии КЗ №10/1 и 12/1. Характеристика препаратов КЗ серий № 10/1 и 12/1 представлена в таблице 4.

Таблица 4 – Характеристики препаратов КЗ серий 10/1 и 12/1

Признак	КЗ №10/1	КЗ №12/1
Диаметр частиц коллоидного золота (dср) по данным электронной микроскопии, нм	26,7
Форма	Овальная, круглая	Овальная, круглая
Однородность	Однородные	Однородные
Наличие конгломератов	-	-
Результаты спектрофотометрии: оптическая плотность (ЕД), max пика поглощения;   длина волны max пика поглощения при измерении в диапазоне λ=200-600 нм	1,020   max при λ=526	0,867   max при λ=525
Диаметр частиц коллоидного золота (dср), определенный по результатам спектрофотометрии, нм [ ]		20-30

Для получения конъюгата с вышеуказанными сериями КЗ рекомендованы МкАт 387. Из данных, представленных в данной работе, следует, что «золотое число» (точка выхода графика на плато) для МкАТ 387 и серии КЗ № 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для МкАТ 387 и серии КЗ № 12/1 соответствует 19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы [87] рекомендуемая концентрация антител для конъюгации с сериями КЗ № 10/1 и 12/1 составляет, соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

Дата добавления: 2015-07-16